劉穎慧 黎金顏 吳又明 李美靈 朱佳敏 何淑明

1南方醫(yī)科大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院（廣州 510515）；2江門市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣東江門 529030）；南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院3病理科，4婦產(chǎn)科（廣東中山 528415）；5咸寧市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（湖北咸寧 437100）

子宮內(nèi)膜癌是婦科常見的三大惡性腫瘤之一，占女性生殖道惡性腫瘤的20%～30%［1］。近年來由于激素的應(yīng)用、肥胖、糖尿病的增多，其發(fā)病率有逐年上升且年輕化的趨勢，已成為威脅女性健康的主要疾?。?］。目前臨床上診斷子宮內(nèi)膜癌常用的腫瘤標(biāo)志物為CA125，但因其敏感性和特異性低而飽受質(zhì)疑，因此尋找新型腫瘤標(biāo)志物具有重要意義。O′SHANNESSY等［3］發(fā)現(xiàn)FRA在約90%子宮內(nèi)膜癌組織中過度表達(dá)，且表達(dá)與腫瘤的分化、分期相關(guān)，但國內(nèi)關(guān)于FRA與子宮內(nèi)膜癌的研究鮮有報(bào)道。因此本研究通過分析不同分型、分期子宮內(nèi)膜癌中FRA表達(dá)的意義，為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。同時(shí)通過對比子宮內(nèi)膜癌血清FRA、CA125的表達(dá)水平評估其臨床診斷價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選取南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖人民醫(yī)院及珠江醫(yī)院2014年1月至2017年8月就診并行手術(shù)治療的子宮內(nèi)膜癌患者術(shù)前血清標(biāo)本50例，甲醛固定石蠟包埋組織標(biāo)本113例，隨機(jī)選取同期確診的正常子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本30例，并留取富有相應(yīng)病變組織的石蠟塊備用。所有患者術(shù)前均未接受放化療、激素及其他輔助治療，術(shù)后診斷均經(jīng)病理證實(shí)。各組年齡間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。子宮內(nèi)膜癌共113例，年齡39～74歲，平均54歲。根據(jù)FIGO 2009年子宮內(nèi)膜癌手術(shù)病理分期，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織共83例（Ⅰ、Ⅱ期43例，Ⅲ、Ⅳ期40例），Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織30例。定義Ⅰ、Ⅱ期為早期內(nèi)膜癌，Ⅲ、Ⅳ期為晚期內(nèi)膜癌。

1.2 血清樣本的采集 所有入組者均于入院第2天清晨空腹抽取靜脈血4 mL，置于未加抗凝劑的試管中，室溫下靜置2 h，離心后取上清液，于-80℃冰箱保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及方法

1.3.1 ELISA法檢測 血清FRA采用ELISA法檢測，血清CA125采用電化學(xué)發(fā)光法檢測。檢測試劑盒購自武漢華美，濃度單位為pg/mL，儀器為THERMO MK3型全自動酶免分析儀。實(shí)驗(yàn)室操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

1.3.2 免疫組化法檢測 組織FRA及CA125含量采用免疫組化法檢測?？乖迯?fù)液（EDTA法）、CA125單克隆抗體TA347及DBA顯色試劑盒購自邁新有限公司（中國福建）；FRA單克隆抗體（稀釋度1∶100）購自Santa Cruz公司（美國）。采用免疫組化SP二步法，嚴(yán)格按照試劑盒說明操作，分別用PBS代替2種一抗作為陰性對照組，已知的陽性卵巢癌切片作為陽性對照。

1.4 免疫組化染色結(jié)果判定 與陰性表達(dá)相比較，F(xiàn)RA及CA125陽性染色為細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒。每個(gè)病例隨機(jī)取有代表性的5個(gè)高倍視野（×40）來判斷結(jié)果。每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)染色程度分為基本不著色為0分，淺棕黃色為1分，中度著色為2分，深棕黃色為3分。陽性細(xì)胞百分率評價(jià)方法：≤10%為0分，11% ～25%為1分，26% ～50%為2分，達(dá)到50%以上為3分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞百分率得分相乘為綜合評分，0分為（-），1～3分為（+），4～7分為（++），8～9分為（+++）；≥（+）為陽性，定義（-）～（+）為低表達(dá)，（++）～（+++）為高表達(dá)［4］。見圖1。

圖1 子宮內(nèi)膜癌組織中FRA、CA125的不同表達(dá)水平（×400）Fig.1 The different expression level of FRA and CA125 in endometrial carcinoma tissue（× 400）

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，等級資料采用頻數(shù)表示，兩獨(dú)立樣本間比較采用Mann?WhitneyU檢驗(yàn)，多組間比較應(yīng)用Kruskal?WallisH檢驗(yàn)，對比分析FRA與CA125的診斷價(jià)值采用ROC曲線，在95%的置信區(qū)間計(jì)算AUC、敏感度、特異度。所有統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同分型、分期子宮內(nèi)膜癌組織中FRA的表達(dá) FRA在正常子宮內(nèi)膜組織、Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌組織、Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織中均可見表達(dá)（陽性率分別為13.3%、97.5%、83.3%，表1）。通過Kruskal?WallisH檢驗(yàn)比較各組間FRA的表達(dá)強(qiáng)度，其中Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的FRA高表達(dá)率高于Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織，Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的FRA高表達(dá)率高于正常子宮內(nèi)膜組織，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。此外，Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌晚期組織FRA高表達(dá)率高于Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌早期組（Z=-2.306，P＜0.05），見表3。

表1 FRA在不同類型子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)情況Tab.1 The expression of FRA in different types of endometrial tissues 例（%）

表2 FRA在不同類型子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度Tab.2 Expression intensity of FRA in different types of endometrial tissues

表3 FRA在不同分期子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)強(qiáng)度Tab.3 Expression intensity of FRA in endometrial tissues at different stages 例

2.2 子宮內(nèi)膜癌血清中FRA與CA125的診斷性能評估 繪制血清FRA、CA125的ROC曲線發(fā)現(xiàn)，當(dāng)血清FRA≥887.525 pg/mL時(shí)，預(yù)測子宮內(nèi)膜癌比較有價(jià)值（AUC 0.775；95%CI0.671～0.879；敏感度為68.0%；特異度為76.7%）。當(dāng)血清CA125≥42.57 U/mL時(shí)，預(yù)測子宮內(nèi)膜癌比較有價(jià)值（AUC 0.638；95%CI0.512～ 0.763；敏感度為66.0%；特異度為66.7%）。ROC曲線分析表明血清FRA的敏感度及特異度均優(yōu)于CA125。聯(lián)合血清FRA與CA125的ROC曲線的AUC為0.809（95%CI0.712～0.906），提示聯(lián)合血清FRA與CA125比單一檢測血清FRA或CA125的準(zhǔn)確率更高，見圖2、表4。

圖2 血清FRA、血清CA125及兩者聯(lián)合預(yù)測子宮內(nèi)膜癌的ROC曲線Fig.2 ROC curves of serum FRA、serum CA125 and their combination in predicting endometrial carcinoma

3 討論

葉酸是DNA合成、細(xì)胞生長的必需物質(zhì)，而FRA能夠以胞吞的形式將葉酸運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi)。FRA的增多可結(jié)合大量葉酸導(dǎo)致DNA突變［5］、細(xì)胞傳導(dǎo)通路激活［6-7］。本團(tuán)隊(duì)的前期研究表明子宮內(nèi)膜從正常增殖到增生，再到癌變的整個(gè)過程，F(xiàn)RA的表達(dá)水平逐步升高［8-9］，提示FRA可能參與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展。CA125是柱狀上皮細(xì)胞分泌的一種糖蛋白，廣泛應(yīng)用于臨床婦科腫瘤的篩查，但其敏感性和特異性均較低，在早期的子宮內(nèi)膜癌患者中，只有10%～20%的患者伴有明顯的CA125升高［10］。一些良性病變?nèi)缱訉m內(nèi)膜異位癥、卵巢囊腫等可導(dǎo)致CA125過表達(dá)［11］。本研究通過對比子宮內(nèi)膜癌血清中的FRA與CA125發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)RA的敏感度及特異度均高于CA125，且聯(lián)合檢測血清FRA與CA125的診斷準(zhǔn)確度較單一檢測血清FRA或CA125高，提示聯(lián)合檢測FRA與CA125可提高子宮內(nèi)膜癌的早期診斷水平，具有重要的診斷價(jià)值。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌的FRA高表達(dá)率高于Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌，可能是由于Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞大多為分化較好的細(xì)胞，腺癌腺體較多，所以分泌的FRA大量增加。而Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞大多為低分化細(xì)胞，低分化細(xì)胞的腺癌腺體較少，同時(shí)部分腺結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致FRA的分泌減少，這提示Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制可能有所不同，但其具體機(jī)制如何有待進(jìn)一步研究。

目前臨床上Ⅲ、Ⅳ期手術(shù)的治療原則是個(gè)體化，以盡可能切除所有肉眼可見到的病灶為目的，但受限于手術(shù)醫(yī)生的主觀感受、臨床經(jīng)驗(yàn)和技術(shù)的不同，導(dǎo)致手術(shù)效果有所差別。KENNEDY等［12］學(xué)者在原發(fā)性肺癌術(shù)中借助FRA靶向特異性熒光顯影劑的熒光反應(yīng)精細(xì)分離癌變組織，手術(shù)效果顯著。本研究將Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌分期后對比發(fā)現(xiàn)，Ⅲ、Ⅳ期的FRA高表達(dá)率高于Ⅰ、Ⅱ期，提示在Ⅲ、Ⅳ期的子宮內(nèi)膜癌變組織中FRA的表達(dá)率高，結(jié)合FRA靶向特異性熒光顯影劑的能力強(qiáng)，可以更有效的顯示癌變組織及手術(shù)切緣，識別淋巴結(jié)受累部位，為今后晚期子宮內(nèi)膜癌應(yīng)用FRA靶向特異性熒光顯影劑進(jìn)行精細(xì)化手術(shù)提供了理論支持，但其實(shí)際效果有待進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。

表4 血清FRA與CA125預(yù)測價(jià)值的比較分析Tab.4 comparative analysis of the predictive value of serum FRA and CA125

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