馬晶晶 廖旭勇 趙玉潔 喻皇飛

1遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（遵義 563000）；2遵義醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科（遵義 563000）；3遵義醫(yī)學(xué)院第三附屬醫(yī)院腫瘤科（遵義 563000）

脊髓損傷（spinal cord injury，SCI）是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的嚴(yán)重性疾病之一，具有高發(fā)病率、高致殘率和高病死率的特點(diǎn)［1］。目前無SCI特異性治療手段，手術(shù)僅對壓迫性及嵌頓性SCI有一定效果，某些激素如甲基強(qiáng)的松龍的治療效果也非常有限。干細(xì)胞移植作為SCI的潛在治療策略之一，備受學(xué)術(shù)界的廣泛關(guān)注［2-3］。目前用于SCI治療研究的干細(xì)胞類型有胚胎干細(xì)胞（ESCs）、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPSCs）、神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs）和間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）等。ESCs和iPSCs盡管分化潛能廣，卻存在致瘤隱患［4］。相比之下，NSCs和MSCs是較為理想的兩種干細(xì)胞類型，但MSCs具有廣泛的組織學(xué)來源，且有免疫調(diào)節(jié)和細(xì)胞因子分泌功能，一直是SCI再生策略研究的熱點(diǎn)［5-6］。在不同組織來源的MSCs中，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（human amniotic mesenchymal stem cells，hAMSCs）具有多系分化特性，低免疫原性，擴(kuò)增能力強(qiáng)、不牽涉?zhèn)惱韱栴}等優(yōu)勢，是理想的供源細(xì)胞類型［7］。此外，我們之前的研究顯示hAMSCs具有對SCI修復(fù)的作用［8-9］。而對于SCI的臨床治療而言，原位移植可能有誘發(fā)損傷脊髓的再次損傷、出血等風(fēng)險(xiǎn)，能否通過改變移植途徑的方式更加有利于SCI的治療是我們所關(guān)心的問題。故本研究擬通過比較經(jīng)原位和靜脈途徑移植hAMSCs對SCI大鼠神經(jīng)功能和組織學(xué)修復(fù)的效果，探討hAMSCs經(jīng)靜脈注射途徑治療SCI的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料及主要試劑 （1）人胎盤組織：經(jīng)知情同意后，無菌采集足月分娩胎盤，HbsAg（-），采集后2 h內(nèi)進(jìn)入實(shí)驗(yàn)程序。（2）實(shí)驗(yàn)動物：清潔級成年雌性SD大鼠28只，體質(zhì)量（220±20）g，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心。（3）主要試劑：LG?DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和膠原酶Ⅱ（Gibco公司），胰酶（Amresco公司），流式熒光抗體（BD公司），抗CD68、GFAP及NeuN抗體（millipore公司），熒光標(biāo)記二抗（Santa Cruz公司）；流式細(xì)胞儀（BD公司）；透射電鏡（Hitachi公司）。

1.2 hAMSCs的分離培養(yǎng) 機(jī)械分離羊膜，剪碎，用0.05%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）37℃消化羊膜碎片30 min，未消化的組織碎片加入0.75 mg/mL的膠原酶消化提取hAMSCs。LG?DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)所分離的hAMSCs細(xì)胞。取第3代細(xì)胞經(jīng)DAPI標(biāo)記后用于細(xì)胞移植。

1.3 hAMSCs的表型鑒定 調(diào)整細(xì)胞濃度至1×106/mL，取細(xì)胞懸液200 μL分別加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體各3 μL，混勻室溫避光孵育20 min，PBS充分洗滌重懸后，流式細(xì)胞儀檢測分析。同型對照為熒光素標(biāo)記的小鼠IgG。

1.4 SCI模型建立和細(xì)胞移植 SD大鼠28只，分為hAMSCs原位移植組，原位移植對照組，hAMSCs移植注射組（靜脈移植對照組，每組各7只。大鼠麻醉后，充分顯露T11段脊髓，用手術(shù)刀片快速橫斷并往返復(fù)切3次，將兩斷端輕輕提起以證實(shí)完全切斷脊髓，逐層縫合傷口。1周后再次暴露損傷脊髓組織，用微量注射器將預(yù)備的細(xì)胞懸液緩慢注入到脊髓兩斷端的灰白質(zhì)交界處，退針前留針5 min。而靜脈移植組大鼠則通過尾靜脈注射相同數(shù)量的細(xì)胞懸液。對照組以PBS替代。術(shù)后截癱護(hù)理，定時(shí)協(xié)助受試大鼠排尿排便。

1.5 行為學(xué)評價(jià) 采用BBB評分法［10］。細(xì)胞移植后每周一次對大鼠進(jìn)行后肢功能測評，共分22個等級，后肢全癱為0分，完全正常為21分。每次測評均在同一時(shí)點(diǎn)進(jìn)行，觀察時(shí)間為5 min，測評前排空膀胱。

1.6 組織學(xué)檢測 實(shí)驗(yàn)截止時(shí)處死的各組大鼠，取出損傷段脊髓，置于30%蔗糖4℃固定后切片，行組織學(xué)檢測：（1）HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)；（2）免疫熒光染色：切片洗滌封閉后分別滴加NeuN（1∶100）、GFAP（1∶200）、CD68（1∶100）抗體，對照組用PBS替代一抗，4°C過夜，洗滌后滴加相應(yīng)熒光二抗室溫孵育2 h，充分洗滌后封片觀察；（3）透射電鏡觀察髓鞘形態(tài)：組織經(jīng)戊二醛和四氧化鋨固定后，環(huán)氧樹脂包埋，切片，乙酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色觀察。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。組間差異比較采用t檢驗(yàn)，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.01表示差異有顯著意義。

2 結(jié)果

2.1 hAMSCs形態(tài)觀察 原代培養(yǎng)的hAMSCs 12 h即有部分細(xì)胞貼壁，3 d后貼壁細(xì)胞迅速增多，由圓形，卵圓形轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮巍⒍嘟切紊L（圖1A）。傳代培養(yǎng)3 d后hAMSCs融合近95%以上，細(xì)胞呈長梭形、紡錘形，單層漩渦放射狀生長（圖1B）。

圖1 hAMSCs生長形態(tài)（×200）Fig.1 Morphology of cultured hAMSCs（× 200）

2.2 hAMSCs表型鑒定 FCM分析結(jié)果表明，培養(yǎng)的hAMSCs高表達(dá)典型MSCs表面標(biāo)記，如CD29、CD44、CD90、CD105和CD166，幾乎不表達(dá)CD80、CD86、CD45、CD34及HLA?DR（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)分析hAMSCs表型Fig.2 Phenotypic analysis of hAMSCs by FCM

2.3 SCI大鼠行為學(xué)觀察 BBB評分如圖3所示，hAMSCs移植后1周，原位移植組大鼠和尾靜脈移植組大鼠的BBB評分分別是3.50±1.48、2.64±0.74，兩組之間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但與同時(shí)點(diǎn)PBS組大鼠的分值（分別是0.71±0.67、0.86±0.61）相比，差異有顯著意義（均P＜0.05）；從術(shù)后1周到第6周，無論是移植組還是相應(yīng)對照組大鼠BBB評分均有升高趨勢，但前兩組上升幅度明顯高于對照組。至第6周，原位移植組大鼠和尾靜脈移植組大鼠BBB分值分別達(dá)6.71±0.70和6.93±1.28，均高于相應(yīng)時(shí)點(diǎn)的PBS對照組評分（均P＜0.05），而原位移植組和尾靜脈移植組之間比較差異仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖3 hAMSCs移植后各組大鼠BBB分值變化Fig.3 BBB scores in rats of different groups with SCI after hAMSCs transplantation

2.4 hAMSCs的體內(nèi)植活 hAMSCs移植后第6周，無論是原位移植組還是尾靜脈移植組大鼠損傷脊髓節(jié)段組織切片中均可見DAPI標(biāo)記陽性細(xì)胞存在（圖4A、B）。原位移植組中DAPI陽性細(xì)胞主要沿針道注射處分布于脊髓灰白質(zhì)組織之中，相對較集中（圖4A）；而尾靜脈移植組DAPI陽性細(xì)胞散在分布于組織中（圖4B）。

圖4 hAMSCs在大鼠受損脊髓組織內(nèi)的植活（×100）Fig.4 Survival of hAMSCs in injured spinal cord of rats after transplantation（× 100）

2.5 損傷脊髓組織學(xué)觀察 HE染色結(jié)果顯示（圖5），hAMSCs移植后第6周，原位移植組、尾靜脈移植組大鼠橫斷損傷區(qū)上下兩殘端脊髓組織得以有效整合連接，連接處見各種細(xì)胞增生，排列紊亂無規(guī)則。同時(shí)也有少量小的空洞形成，可見炎細(xì)胞浸潤（圖5A、C）。PBS對照組大鼠SCI區(qū)組織呈現(xiàn)較大的空洞及明顯的囊腔并伴隨細(xì)胞的紊亂排列，損傷脊髓段中間幾乎未見組織結(jié)構(gòu)相連，僅在其兩側(cè)有少許組織得以連接兩殘端組織（圖5B、D）。

2.6 損傷脊髓組織免疫熒光染色 免疫熒光染色結(jié)果顯示（圖6），hAMSCs細(xì)胞移植第6周，hAM?SCs原位移植組和尾靜脈移植組在損傷脊髓組織可見大量NeuN染色陽性神經(jīng)細(xì)胞，而PBS對照組脊髓組織中的NeuN陽性細(xì)胞明顯減少。GFAP陽性神經(jīng)纖維在hAMSCs原位移植組和尾靜脈移植組損傷段脊髓組織中的表達(dá)相似，呈細(xì)絲狀均質(zhì)散在分布；而其在相應(yīng)的PBS對照組大鼠的受損脊髓則呈集束狀，形狀粗大，相互匯集纏繞，主要分布于受損脊髓段的空洞和囊腔邊緣；CD68的表達(dá)分布與GFAP頗為相似，主要集中受損脊髓囊腔和空洞邊緣，在hAMSCs原位移植組和尾靜脈移植組，CD68陽性細(xì)胞在損傷段脊髓組織內(nèi)呈均勻散在分布，未見明顯聚集成簇現(xiàn)象。

2.7 損傷脊髓組織髓鞘觀察 如圖7顯示，脊髓損傷hAMSCs細(xì)胞移植后第6周，hAMSCs原位移植組和尾靜脈移植脊髓組織中見部分板層松懈，但髓鞘結(jié)構(gòu)規(guī)則完整，呈圓形或卵圓形（圖7A、C）。而在PBS對照組中，損傷段脊髓組織均可見大量形態(tài)異常的髓鞘結(jié)構(gòu)，髓鞘板層結(jié)構(gòu)嚴(yán)重松解、扭曲，整體呈空泡化改變明顯，部分髓鞘結(jié)構(gòu)高度水腫變形，甚至崩解，以原位移植對照組更甚（圖7B、D）。

3 討論

盡管MSCs移植治療SCI具有廣闊的應(yīng)用前景，但也存在著很多問題需要關(guān)注和探索。除了供源細(xì)胞的組織學(xué)來源、類型和分化潛能外，合適的、方便快捷的移植途徑更符合臨床需求。我們之前的研究首次證實(shí)了hAMSCs原位移植具有對SCI大鼠組織學(xué)修復(fù)和神經(jīng)功能重建的能力［8-9］，在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)靜脈移植hAMSCs對SCI大鼠的神經(jīng)功能和組織結(jié)構(gòu)同樣具有修復(fù)作用。hAMSCs能夠在移植后第6周的脊髓損傷段組織中植活，說明靜脈移植hAMSCs仍可遷徙到病損組織。hAMSCs這種能力和其本身固有的低免疫原性不無關(guān)系［11］。由于不表達(dá)CD80、CD86和HLA?DR等多種免疫相關(guān)分子，hAMSCs移植后不引起宿主的排異，能夠通過體循環(huán)定植于損傷部位發(fā)揮修復(fù)作用的特點(diǎn)，是hAMSCs作為供源細(xì)胞的優(yōu)勢之一。

在實(shí)驗(yàn)中，我們觀察到hAMSCs移植后NeuN陽性表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞明顯增多。而GFAP陽性神經(jīng)纖維在對照組損傷端變形打結(jié)，而在移植組卻均勻分布的現(xiàn)象充分說明hAMSCs移植不僅利于促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞的存活，還可通過抑制膠質(zhì)細(xì)胞增生減少膠質(zhì)瘢痕的形成。此外，我們還觀察了CD68陽性小膠質(zhì)細(xì)胞在PBS組脊髓缺損殘端聚集。研究顯示，在SCI后損傷早期，小膠質(zhì)細(xì)胞活化，釋放白細(xì)胞介素、TNF等大量細(xì)胞因子加重炎癥反應(yīng)，對神經(jīng)元產(chǎn)生毒害作用。而在晚期小膠質(zhì)細(xì)胞又可通過清除細(xì)胞間的毒素并分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子起到神經(jīng)保護(hù)作用［12］。鑒于小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)組織損傷修復(fù)過程中的作用，結(jié)合我們的結(jié)果，我們懷疑hAMSCs移植可調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的生物學(xué)行為，減輕了其對神經(jīng)元的毒害作用，使得損傷后組織向有利于修復(fù)的方向轉(zhuǎn)化。

對于MSCs移植促進(jìn)SCI組織和功能修復(fù)的機(jī)制尚不清楚，目前認(rèn)為主要有以下幾種方式：（1）MSCS在微環(huán)境作用分化成神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)揮神經(jīng)傳導(dǎo)替代作用，有助于神經(jīng)功能的修復(fù)［13］；（2）MSCS通過分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子及細(xì)胞因子，進(jìn)而改善神經(jīng)功能［14］；（3）MSCs通過某種方式激活神經(jīng)組織預(yù)存的NSCs，調(diào)節(jié)組織再生修復(fù)［15］。（4）移植的MSCs形成有益微環(huán)境，引導(dǎo)軸突生長以促進(jìn)神經(jīng)系統(tǒng)的修復(fù)［16］。理論上講，經(jīng)不同途徑植入hAMSCs，可能會由于作用機(jī)制的不同，所產(chǎn)生的治療效果亦存在一定差異。而我們的結(jié)果卻顯示，兩種移植方式無論在組織學(xué)修復(fù)還是神經(jīng)功能改善的程度上有著相似的效果，說明靜脈移植途徑同樣是hAMSCs治療SCI的有效途徑的同時(shí)，也提示著這兩種方式有著相似的修復(fù)機(jī)制。研究顯示，hAMSCs可以分泌血管內(nèi)皮生長因子、神經(jīng)生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)素3、腦鈉素、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子等多種細(xì)胞因子和營養(yǎng)因子參與神經(jīng)細(xì)胞的存活，遷移或分化［17］。大量營養(yǎng)因子或細(xì)胞因子的分泌又可改善機(jī)體損傷后的整體狀態(tài)和局部微環(huán)境［18］，這可能是靜脈移植途徑具有原位移植相同修復(fù)效果的機(jī)制之一。而hAMSCs究竟產(chǎn)生了哪些因子參與SCI的修復(fù)，則是我們下一步需要深入的研究的內(nèi)容。

圖7 損傷段脊髓組織中髓鞘形態(tài)（×5 000）Fig.7 Morphology of medullary sheath in injured spinal cord（×5 000）

參考文獻(xiàn)

［1］RAHIMI?MOVAGHAR V，SAYYAH M K，AKBARI H，et al.Epidemiology of traumatic spinal cord injury in developing coun?tries：a systematic review［J］.Neuroepidemiology，2013，41（2）：65?85.

［2］QU J，ZHANG H.Roles of mesenchymal stem cells in spinal cord injury［J］.Stem Cells Int，2017，2017：5251313.

［3］楊瑞瑞，鄧宇斌.干細(xì)胞修復(fù)脊髓損傷的研究現(xiàn)狀［J］.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2017，33（1）：10?13.

［4］ASSINCK P，DUNCAN G J，HILTON B J，et al.Cell trans?plantation therapy for spinal cord injury［J］.Nat Neurosci，2017，20（5）：637?647.

［5］MATYAS J J，STEWART A N，GOLDSMITH A，et al.Effects of bone?marrow?derived MSC transplantation on functional recovery in a rat model of spinal cord injury：comparisons of transplant locations and cell concentrations［J］.Cell Trans?plant，2017，26（8）：1472?1482.

［6］ROPPER A E，THAKOR D K，Han I，et al.Defining recovery neurobiology of injured spinal cord by synthetic matrix?assisted hMSC implantation［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2017，114（5）：E820?E829.

［7］KIM E Y，LEE K B，KIM M K.The potential of mesenchymal stem cells derived from amniotic membrane and amniotic fluid for neuronal regenerative therapy［J］.BMB Rep，2014，47（3）：135?140.

［8］喻皇飛，方寧，余麗梅，等.人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植對大鼠脊髓損傷后NGF、BDNF和Nogo?AmRNA表達(dá)的影響［J］.中國脊柱脊髓雜志，2013，23（10）：924?929.