賴舒暢 邱鴻 王肖 潘道延 王楨鈺 李凱 白曉春 沈潔

1南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科（廣州 510515）；2南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實驗研究中心（廣州 510515）；3廣州中醫(yī)藥大學(xué)經(jīng)濟與管理學(xué)院（廣州 510515）

糖尿病的病因十分復(fù)雜，遺傳、環(huán)境、行為等多種因素共同參與、相互作用而導(dǎo)致糖尿病的發(fā)生。全球的糖尿病患者超過4.15億，預(yù)計到2040年前，全球?qū)⒂?.42億糖尿病患者，這將給個人及社會帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)［1］。

哺乳類動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是一種高度保守的絲氨酸-蘇氨酸類激酶，通過在體內(nèi)形成兩種不同的復(fù)合體對機體生長、代謝產(chǎn)生調(diào)控作用。mTOR與肥胖、糖尿病等代謝性疾病關(guān)系密切，在胰島素信號通路，胰島β細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖以及調(diào)控代謝調(diào)節(jié)激素的合成分泌等多種途徑中發(fā)揮重要作用［2-3］。DEPTOR 是 2009 年，PETERSON 等［4］發(fā)現(xiàn)一類新的mTOR結(jié)合蛋白，能夠負(fù)性調(diào)節(jié)mTORC1和mTORC2的活性。盡管許多體外實驗已經(jīng)證實DEPTOR負(fù)性調(diào)控mTOR的作用，DEPTOR在體內(nèi)的作用仍然很少被了解。近年來研究發(fā)現(xiàn)，DEP?TOR對細(xì)胞代謝也有著重要的影響。然而，目前對DEPTOR在代謝中作用的研究多數(shù)集中在細(xì)胞和分子水平，為進一步了解DEPTOR的作用，本課題組根據(jù)國際上常用的Cre/loxp系統(tǒng)原理，利用DEPTORloxp/loxp小鼠和胰島β細(xì)胞特異性表達Cre重組酶小鼠Ins1?Cre/ERT小鼠，成功構(gòu)建并鑒定了可誘導(dǎo)性胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，為在整體動物水平研究DEPTOR基因在胰島β細(xì)胞中的作用及糖尿病的發(fā)病機制提供了研究平臺。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 鼠尾基因組DNA裂解液（A/B液）南方醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院中心實驗室配制：A液（0.5%SDS、0.1M NaCl、0.05M EDTA、0.01M Tris.C1 pH8.0、100 μg/mL蛋白酶K），B液（NAOH 1 mmol/mL）；DNA Marker（Gen Star，Lot#6BB02）、瓊脂糖（BIOFROXX）購自廣州斯佳生物有限公司；EB替代物（GR501?01）、PCRmix（P212?02）南京諾唯贊生物科技有限公司；PCR、QPCR引物均為上海生物工程有限公司合成；DEPTOR一抗、熒光二抗（Abcam）購自廣州新晉生物有限公司；Insulin一抗（santa cruz），DAPI（invitrogen）購自廣州杰特偉生物科技有限公司；其他常用試劑：EDTA、Tris堿、鹽酸、氫氧化鈉、等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 實驗動物

1.2.1 條件性胰島β細(xì)胞特異表達Cre重組酶小鼠 B6.Cg?Tg（Ins1?cre/ERT）1Lphi/J小鼠（JAX#024709，以下簡稱Cre小鼠）由上海茂生生物有限公司代理從美國JACKSON實驗室引進。

1.2.2 DEPTORloxp/loxp小鼠DEPTORtm1a（EUCOMM）

Wtsi克隆胚胎干細(xì)胞EPD0556_1_H09購自歐洲突變小鼠資源庫（EUCOMM ID：41725，德國），種系傳播嵌合小鼠由上海南方模式生物中心構(gòu)建。野生型（C57BL/6）小鼠購自南方醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.2.3 兩種基因小鼠的飼養(yǎng)和繁殖 將小鼠置于潔凈的層流動物房內(nèi)，室內(nèi)溫度控制在20～25℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照，晝夜交替。DEPTORloxp/loxp采用雌雄均為DEPTORloxp/loxp的純合子進行交配繁殖，Cre小鼠采用Cre重組酶雜合子（Cre+/-）和野生型小鼠進行交配繁殖。動物實驗經(jīng)過南方醫(yī)科大學(xué)倫理委員會審核。

1.2.4 條件性胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠的構(gòu)建流程 基于Cre/loxp系統(tǒng)原理，構(gòu)建流程如下：DEPTORloxp/loxp小鼠與Cre+/-小鼠交配，得到F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠。獲得的F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-小鼠再與DEPTORloxp/loxp小鼠交配，得到DEP?TORloxp/lox.Cre+/-小鼠。DEPTORloxp/lox.Cre+/-基因型小鼠即為本實驗所要構(gòu)建模型小鼠的基因型。在小鼠胰島β細(xì)胞中，胰島素與外源性他莫昔芬同時作用下可誘導(dǎo)Cre重組酶表達，Cre重組酶能有效切除兩個LoxP位點間的序列。因此通過控制外源性注射他莫昔芬時間可獲得不同周齡胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠。

1.3 小鼠基因型鑒定

1.3.1 小鼠組織DNA提取 于3～4周齡時候剪取小鼠鼠尾約2 mm，并置于1.5 mL EP管中。加入100 μL鼠尾裂解液A液，100℃金屬浴加熱1 h；4 000轉(zhuǎn)離心5 min，吸取上清移入新的EP管中；加入鼠尾裂解液B液100 μL，振蕩混勻，制得DNA模板于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR反應(yīng)及瓊脂糖電泳和成像分析 利用DEPTOR基因和Cre基因的鼠特異性引物（表1A）進行PCR反應(yīng)。DEPTOR基因PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，引物各 2 μL（引物濃度為 10 μm），模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補足體積。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性3 min，94℃變性30 s、57℃退火1 min、72℃延伸30 s，35個循環(huán)；最后72℃延伸2 min，4℃保存?zhèn)溆谩re基因PCR反應(yīng)體系（20 μL）：Pcrmix 10 μL，目的基因引物2 μL（引物濃度為10 μm）和內(nèi)參引物1 μL（引物濃度為10 μm），模板DNA 2 μL，加滅菌蒸餾水補足體積。反應(yīng)條件為第一階段94℃預(yù)變性2 min，94℃變性20 s、65℃退火15 s、68℃延伸10 s，10個循環(huán)；第二階段94℃變性15 s、60℃退火15 s、72℃延伸10 s，10個循環(huán)；第三階段72℃延伸2 min，10℃保存?zhèn)溆谩煞N基因PCR反應(yīng)終產(chǎn)物（6 μL/孔）進行2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)分析結(jié)果。

1.4 胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠敲除效果驗證 對8周齡目的基因鼠（KO）和對照組鼠（Control）連續(xù)腹腔注射他莫昔芬（50 mg/kg）1周，于第12周時處死小鼠，取小鼠一部分胰腺組織提取RNA和總蛋白，剩余胰腺組織制成石蠟切片。按照常規(guī)QPCR、Western blot、免疫熒光步驟進行DEPTOR基因敲除效果的驗證。

2 結(jié)果

2.1 DEPTORloxp/loxp、Cre+/-和 DEPTORloxp/loxpCre+/-小鼠繁殖及鑒定情況 DEPTORloxp/loxp小鼠純合子自交繁殖，依據(jù)遺傳定律，其子代小鼠的基因型均DEPTORloxp/loxp純合小鼠，從引進開始繁殖10個月，共繁殖34只DEPTORloxp/loxp純合小鼠，子代小鼠皮膚及毛發(fā)均為黑色，部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖1；Cre小鼠（黑色）和野生型C57小鼠（黑色）雜交，共獲得子代41只，其中重組酶Cre表達陽性的小鼠22只（占總數(shù)53.7%），部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖2；DEPTORloxp/loxp與Cre小鼠雜交獲得F1代58只，其中F1代DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠30只（占總數(shù)51.7%），部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖 3；DEPTORloxp/-。Cre+/-鼠與 DEPTORloxp/loxp鼠雜交，共獲得F2代鼠43只，其中DEPTORloxp/loxp?Cre+/-10只（占總數(shù)23.3%），部分子代小鼠基因型鑒定結(jié)果如圖4。

圖1 DEPTORloxp/loxp小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.1 PCR genotyping results of DEPTORloxp/loxpmice

圖2 表達Cre重組酶小鼠基因PCR型鑒定結(jié)果Fig.2 PCR genotyping results of Cre recombinase mice

圖3 F1代小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR genotyping results of the first?generation offsprings

2.2 QPCR、Western blot、免疫熒光驗證DEPTOR基因敲除效果 提取KO小鼠和Control小鼠胰腺組織RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，根據(jù)特異性引物（表1B）進行定量PCR檢測（QPCR），提取KO小鼠和Control小鼠胰腺組織蛋白進行Western blot檢測。由結(jié)果圖5可見，KO小鼠DEPTOR mRNA（A）與蛋白（B）表達水平低于Control小鼠，差異顯著（Mean±SD，n=3）。**P＜ 0.05；進一步驗證DEPTOR敲除效果是發(fā)生在胰島β細(xì)胞，進行免疫熒光雙標(biāo)染色，結(jié)果如圖5可見DEPTOR基因主要表達在胰腺導(dǎo)管，但在胰島β細(xì)胞中也有表達，且DEP?TOR基因表達量Control小鼠（C圖）要明顯高于KO小鼠（D圖）。

圖4 F2代小鼠基因型PCR鑒定結(jié)果Fig.4 PCR genotyping results of the second?generation offsprings

圖5 QPCR、Western blot、免疫熒光(20 ×)驗證DEPTOR基因敲除效果Fig.5 QPCR、Western blot and Immunofluorescence(20 ×)were applied to identify the knockout effect of DEPTOR gene

表1 基因型鑒定（A）和QPCR（B）的引物信息Tab.1 Primer Information for genotyping（A）and QPCR（B）

3 討論

隨著對基因組學(xué)的研究深入，基因敲除技術(shù)的使用也越來越普遍，通過建立穩(wěn)定的實驗動物基因敲除模型是研究基因功能的常規(guī)策略。本文所提及的條件性基因敲除是利用Cre/Loxp重組系統(tǒng)介導(dǎo)基因打靶的方法。Cre重組酶由Cre基因編碼，類似于一把基因剪刀，可識別特異DNA序列（如Loxp位點），可剪切掉Loxp位點之間的靶基因，從而達到靶基因敲除的目的。條件性基因敲除所指的是對Cre基因進行調(diào)控，在Cre基因插入特定的可被調(diào)控的啟動子序列，即可人為的控制Cre基因的表達，從而可以在時間和空間研究某個特定基因的功能。

在人體，DEPTOR基因位于第八號染色體，8q24，12，分子量 48 kDa，是一類在 mTORCl和mT0RC2均含有的結(jié)合蛋白，以其PDZ域與mTOR相互作用。DEPTOR作為mTOR家族的一個重要成員，對細(xì)胞代謝也有著重要的影響。在肌肉中，Baf60c能通過激活DEPTOR介導(dǎo)的Akt/PKB通道促進糖的有氧氧化向糖酵解的肌纖維類型轉(zhuǎn)變［5］。在肝臟，肝DEPTOR缺失改變空腹代謝轉(zhuǎn)變［6］。DEPTOR還通過激活A(yù)kt?PPAR?γ信號軸能促進白色脂肪組織生成［7］。此外，有研究顯示DEPTOR啟動子區(qū)域基因突變與肥胖的兒童和青少年患胰島素抵抗的發(fā)生風(fēng)險顯著下降相關(guān)［8］。由于對DEPTOR基因與糖代謝及糖尿病的研究多集中在細(xì)胞及組織水平，缺乏整體動物水平上的研究。因此，構(gòu)建DEPTOR基因敲除小鼠模型對進一步深入研究DEPTOR的功能極為重要。此外，β細(xì)胞的研究在糖尿病研究領(lǐng)域占據(jù)著不可動搖的主導(dǎo)地位。本實驗構(gòu)建了條件性胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，可在不同的時間節(jié)點上在胰島β細(xì)胞對DEPTOR基因進行調(diào)控，能更進一步研究DEPTOR基因的功能。

綜上所述，本實驗利用Cre/Loxp重組系統(tǒng)成功構(gòu)建了條件性胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，該小鼠和正常野生型小鼠在生長速度、繁殖能力等方面無明顯差異，在糖耐量上出現(xiàn)異常。這是國際上首次利用Cre/Loxp技術(shù)構(gòu)建條件性胰島β細(xì)胞DEPTOR基因敲除小鼠模型，為進一步研究DEPTOR基因與糖尿病發(fā)生機制中扮演的角色提供了重要的動物模型。

參考文獻

［1］OGURTSOVA K，DA R F J，HUANG Y，et al.IDF Diabetes Atlas：Global estimates for the prevalence of diabetes for 2015 and 2040［J］.Diabetes Res Clin Pract，2017，128：40?50.

［2］DANN S G，SELVARAJ A，THOMAS G.mTOR Complex1?S6K1 signaling：at the crossroads of obesity，diabetes and can?cer［J］.Trends Mol Med，2007，13（6）：252?259.

［3］GU Y，LINDNER J，KUMAR A，et al.Rictor/mTORC2 is es?sential for maintaining a balance between beta?cell proliferation and cell size［J］.Diabetes，2011，60（3）：827?837.

［4］PETERSON T R，LAPLANTE M，THOREEN C C，et al.DEP?TOR is an mTOR inhibitor frequently overexpressed in multiple myeloma cells and required for their survival［J］.Cell，2009，137（5）：873?886.

［5］MENG Z X，LI S，WANG L，et al.Baf60c drives glycolytic metabolism in the muscle and improves systemic glucose homeo?stasis through DEPTOR?mediated Akt activation［J］.Nat Med，2013，19（5）：640?645.

［6］CARON A，MOUCHIROUD M，GAUTIER N，et al.Loss of hepatic DEPTOR alters the metabolic transition to fasting［J］.Mol Metab，2017，6（5）：447?458.

［7］LAPLANTE M，HORVAT S，F(xiàn)ESTUCCIA W T，et al.DEPTOR cell?autonomously promotes adipogenesis，and its expression is associated with obesity［J］.Cell Metab，2012，16（2）：202?212.

［8］KOVAC J，SUTUS T T，ROZMARIC T，et al.DEPTOR pro?moter genetic variants and insulin resistance in obese children and adolescents［J］.Pediatr Diabetes，2017，18（2）：152?158.