付紅霞 馬志鵬 儲(chǔ)承科 郭興榮十堰市太和醫(yī)院（湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院）檢驗(yàn)科（湖北十堰 44000）；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院胚胎干細(xì)胞研究湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（湖北十堰 44000）

神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤是最常見的顱內(nèi)腫瘤，具有高發(fā)病率、高致死率等特點(diǎn)［1-2］。患者接受手術(shù)與化療后的中位生存時(shí)間僅2～3年。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤所具有細(xì)胞結(jié)構(gòu)混雜、彌漫性的侵襲力、高耐藥性等特性，給研究者帶來了巨大的挑戰(zhàn)［3］。因此，急需開發(fā)安全高效的腦膠質(zhì)瘤治療新方法，而生物治療是最有前景的方案之一。

基因治療是非常有潛力的生物治療方法之一。自MSCs的腫瘤歸巢性被發(fā)現(xiàn)后，以抗癌基因編輯MSCs介導(dǎo)治療腫瘤的研究越來越受到人們關(guān)注［4］。我們前期研究利用MSC介導(dǎo)的單一TRAIL［5］或 PTEN［6］基因均可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡，但局限于攜帶單一抗癌基因所進(jìn)行的腫瘤靶向治療的研究，在面對腫瘤多變性與個(gè)體差異性情況下，難以獲得良好的治療效果。為解決單基因抵抗問題，我們選取通過外源性通路導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡的TRAIL基因和通過內(nèi)源性通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的PTEN基因組合作，構(gòu)建MSC介導(dǎo)的雙基因共表達(dá)系統(tǒng)作用于腦膠質(zhì)瘤，來研究其對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用。

傳統(tǒng)的基因編輯載體如病毒、DNA載體等由于轉(zhuǎn)染效率低及可能引起基因重組、突變等問題限制其臨床應(yīng)用［7］。近年來，一種新的安全高效體外合成mRNA的基因治療方法吸引著研究者們的目光［8］。利用體外合成mRNA的方法已廣泛應(yīng)用于在多能干細(xì)胞或體細(xì)胞的編程及誘導(dǎo)分化等方面［9-10］。

本文將采用體外制備TRAIL及PTEN基因的mRNA，共轉(zhuǎn)染入MSC中，使兩種抗癌蛋白共表達(dá)，協(xié)同高效殺傷腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞。本研究將為開發(fā)高效、安全的的腦膠質(zhì)瘤基因治療提供策略，為今后的臨床應(yīng)用多基因聯(lián)合靶向治療疾病打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和培養(yǎng)條件 MSCs從人的胰腺組織內(nèi)分離得到，體內(nèi)增殖擴(kuò)增的方法如前所述［11］。人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞DBTRG?LUC購自ATCC，嚴(yán)格按照ATCC建議方法培養(yǎng)，其培養(yǎng)條件與MSCs保持一致。

1.2 PTEN-與TRAIL?mRNA體外合成 體外RNA合成過程如圖1A所示，人5′UTR的Kozak序列和3′UTR序列由公司合成，克隆到pcDNA3.3載體后命名為pcDNA 3.3?TOPOTA載體。限制性內(nèi)切酶切開質(zhì)粒后作為tail PCR的模板。利用MEGAscript T7試劑盒合成，將ARCA帽子類似物、三磷酸腺苷、GTP、5?甲基胞嘧啶和假尿嘧啶等37℃孵育5 h后，再用堿性磷酸酶37℃處理2 h去除5′?三磷酸。合成的RNA用Ambion MEGA clear spin columns純化然后測定濃度后保存使用。

1.3 PTEN-與TRAIL?mRNA轉(zhuǎn)染MSCs表達(dá)檢測 按TransIT?mRNA說明書操作，將mRNA用Opti?MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋，然后將Boost reagent和TransIT?mRNA試劑依次按順序加入上步溶液中，室溫孵育2 min后，加入含完全培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)。培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱內(nèi)，分別于6和12 h后檢測基因的表達(dá)情況。成功轉(zhuǎn)染相應(yīng)mRNA的MSCs分別命名為MSC?TRAIL，MSC?PTEN和MSC?T+P。

1.4 間接共培養(yǎng)的方法檢測腫瘤細(xì)胞的活力0 d時(shí)，將DBTRG?LUC細(xì)胞以5 × 103個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。1 d時(shí)將96孔板中培養(yǎng)基換為從 MSCs（CM）或轉(zhuǎn)染 PTEN mRNA、TRAIL mRNA或者共轉(zhuǎn)MSC的條件培養(yǎng)基（CM）（CM?PTEN、CM?TRTIL、CM?TRTIL/PTEN），按0%、25%、50%、75%和100%CM5種濃度梯度分別加入到100 μL MEM完全培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)。在第0、3、6天時(shí)利用小鼠活體成像儀檢測發(fā)光強(qiáng)度。

1.5 transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)檢測MSCs的遷移能力 將DBTRG?LUC細(xì)胞按1×105個(gè)/孔接種到24孔板內(nèi)，將野生型 MSCs、MSC?TRAIL、MSC?PTEN或MSC?TRTIL/PTEN用無血清的培養(yǎng)基混勻加到transwell小室的微孔膜上。培養(yǎng)48 h后，95%乙醇固定小室，0.1%結(jié)晶紫染色。100×顯微鏡下分別隨機(jī)選取5個(gè)視野記數(shù)穿過的細(xì)胞數(shù)。將上述的DBTRG?LUC細(xì)胞換為野生型MSCs重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為正常細(xì)胞的移能力對照。

1.6 熒光顯微鏡分析 0 d，將DBTRG?LUC細(xì)胞按1×105個(gè)/孔的密度接種到24孔板內(nèi)。1 d時(shí)，將原培養(yǎng)基換為50%或者100%的CM。4 d時(shí)加入新鮮配置的工作液（含1 μmol/L calcein AM和2 μmol/L EthD?1，250 μL/孔）置于暗室中孵育 10 min。ImageJ處理分析熒光顯微鏡觀察的圖片。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 利用SPSS 10統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間差異用兩樣本均數(shù)t檢驗(yàn)，率的比較用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05表示差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTEN-與TRAIL?mRNA的體外合成及鑒定 mRNA合成流程如圖1A所示，以前期構(gòu)建載體為模板構(gòu)建具有分泌型信號肽的PTEN和TRAIL mRNA合成載體利用GFP?mRNA為對照檢測mRNA轉(zhuǎn)染效率，結(jié)果顯示GFP?mRNA轉(zhuǎn)染MSCs效率可高達(dá)98.6%（圖1B）。與對照組對比轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中TRAIL和PTEN的蛋白表達(dá)量明顯增多，在培養(yǎng)基中也能檢測到分泌形式的TRAIL和PTEN蛋白（圖1C）。

2.2 轉(zhuǎn)染TRAIL、PTEN mRNA對MSCs遷移能力影響 經(jīng)過48 h的間接共培養(yǎng)，transwell結(jié)果顯示，與野生 MSCs對比 TRAIL?和 PTEN?mRNA 的轉(zhuǎn)染并沒有降低MSCs向DBTRG細(xì)胞的遷移能力（圖2A），反而MSC?TRAIL、MSC?PTEN和MSC?TRAIL/PTEN的遷移能力明顯的增強(qiáng)（圖3C）。而對照組（小室底部沒有鋪DBTRG?LUC細(xì)胞）中以上各組細(xì)胞并未遷移（圖2B）。

活體成像儀檢測結(jié)果如圖3a所示，隨著CM比例提高和培養(yǎng)時(shí)間延長，DBTRG?LUC細(xì)胞的熒光強(qiáng)度逐漸降低。在CM（25%）時(shí)，共培養(yǎng)6 d后，DB?TRG?LUC細(xì)胞死亡率均顯著增高（P＜0.05）（圖3b1）；在共培養(yǎng)的第3天，CM（75%）的CM?TRTIL、CM（50%）的CM?PTEN和CM（25%）的CM?TRTIL/PTEN時(shí)已經(jīng)開始有細(xì)胞死亡（P＜0.05）（圖3b2～4）。然而，RTCA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示在加入CM 20 h后就對DBTRG?LUC細(xì)胞活力有影響（圖4）。

圖1 mRNA的體外合成與轉(zhuǎn)染表達(dá)情況Fig.1 mRNA synthesis and in vitro expression in MSCs

圖2 Transwell檢測MSCs遷移能力Fig.2 In vitro migratory ability of MSCs

利用LIVE/DAED Viability/Cytotoxicity Assay Kit分析CM對DBTRG?LUC細(xì)胞致死作用，在50%和100%CM培養(yǎng)DBTRG?LUC細(xì)胞4 d后，與正常MSC細(xì)胞的CM對比CM?PTEN、CM?TRTIL及CM?TRTIL/PTEN能顯著引起DBTRG?LUC細(xì)胞死亡（圖5）。

圖3 DBTRG?LUC細(xì)胞活力檢測Fig.3 Assessment of DBTRG cell viability using bioluminescence determination

圖4 利用RTCA實(shí)時(shí)分析CM對DBTRG細(xì)胞的殺傷作用Fig.4 Real?time assessment of conditioned medium（CM）?induced cytotoxicity in DBTRG cells

3 討論

惡性膠質(zhì)瘤很難治愈，主要是由它的生長位置和容易遷移侵襲的特性決定的［12］。自從MSCs的腫瘤趨向性被發(fā)現(xiàn)以來，利用特定抗癌基因編輯的MSCs已逐漸成為最有潛力的靶向治療膠質(zhì)瘤方法。然而，用病毒或質(zhì)粒載體攜帶抗癌基因的MSCs不能應(yīng)用于臨床治療。

最新的體外合成mRNA方法，是一種安全高效的基因治療方法，它可完全排除對宿主基因的修飾，并已被證實(shí)可應(yīng)用于臨床研究［13］。因此，利用體外合成特定抗癌基因mRNA編輯MSCs的方法具有臨床應(yīng)用價(jià)值。

腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（TARIL）基因可以通過激活死亡受體促使腫瘤細(xì)胞凋亡而又不損傷正常細(xì)胞［14］，這使其成為抗腫瘤藥物結(jié)合的潛在靶點(diǎn)。幾乎所有腦膠質(zhì)瘤患者都伴有PTEN基因表達(dá)活性的低下，高達(dá)40%的腦膠質(zhì)瘤是由PTEN基因突變所致，以增強(qiáng)PTEN基因表達(dá)活性為手段的抗癌研究一直受到廣泛的關(guān)注［15］。鑒于此，我們體外合成能表達(dá)分泌TARIL、PTEN蛋白的mRNA，并用它們分別編輯MSC應(yīng)用于治療癌癥研究，探討它潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。

如圖1所示，體外合成的mRNA均得到了正確表達(dá)具有分泌性蛋白。并且體外合成的TARIL、PTEN mRNA不僅沒有降低MSCs的遷移能力，反而大大增加了它們對DBTRG細(xì)胞的遷移作用（圖2）。通過間接共培養(yǎng)方法發(fā)現(xiàn)，DBTRG細(xì)胞對CM?PTEN和CM?TRTIL非常敏感，用很低濃度的CM就可以在短時(shí)間內(nèi)造成DBTRG細(xì)胞大量死亡，并且PTEN和TRAIL?mRNA聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯（圖3～4）。以上結(jié)果提示當(dāng)單獨(dú)應(yīng)用一種mRNA對腫瘤殺傷效果不明顯時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用多種mRNA也是提高療效的一種手段。

本研究利用體外合成抑癌基因TRTIL、PTEN mRNA修飾MSC作用于膠質(zhì)瘤細(xì)胞，首次成功開拓了一種高效、安全、可靠雙基因共表達(dá)系統(tǒng)治療腫瘤新方法，為后期體內(nèi)研究和臨床應(yīng)用治療腫瘤提供了一種全新思路。然而TRTIL、PTEN雙基因共表達(dá)系統(tǒng)的高效殺傷腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制目前不是很清楚，以及在體內(nèi)雙基因表達(dá)系統(tǒng)作用是否優(yōu)于單基因作用效果，還需要進(jìn)一步研究。

圖5 間接共培養(yǎng)分析DBTRG?LUC的活力檢測Fig.5 DBTRG?LUC cell viability of indirect co?cultures

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