梁紅玲 黃健清 金田恩 李洪勝 姜明 陳忠生 蘭卉 譚小軍

1廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（廣州 510095）；2廣州醫(yī)科大學(xué)（廣州 510006）；3廣州達(dá)安臨床檢驗(yàn)中心（廣州 510520）

乳腺癌是全球女性發(fā)病率及病死率最高的惡性腫瘤，耐藥是其居高不下的重要原因之一［1-2］。BIM（Bcl?2 interacting mediator of cell death）是 Bcl?2家族成員之一，在乳腺癌、肺癌、骨肉瘤和黑色素瘤中具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用［3-4］。近期發(fā)現(xiàn)BIM缺失多態(tài)性與EGFR（+）NSCLC等腫瘤靶向抑制劑的療效不佳相關(guān)［5］。隨后，更多的研究發(fā)現(xiàn)BIM缺失多態(tài)性是非小細(xì)胞肺癌、慢性粒細(xì)胞白血病、急性粒細(xì)胞白血病以及乳腺癌不良預(yù)后的腫瘤分子標(biāo)志物［6-10］。然而，BIM缺失多態(tài)性與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機(jī)制的研究鮮見相關(guān)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)將篩查出BIM缺失多態(tài)性人乳腺癌細(xì)胞株，測(cè)定其紫杉醇藥物的敏感性以及檢測(cè)BIM在乳腺癌細(xì)胞中mRNA及蛋白水平的表達(dá)情況，探討B(tài)IM缺失多態(tài)性與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機(jī)制的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 本研究所用人乳腺癌細(xì)胞株（MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、T47D）及肺癌細(xì)胞株（HCC2279）均為廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所細(xì)胞庫(kù)儲(chǔ)存。RPMI1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibcol公司）；胎牛血清、胰蛋白酶（BioInd公司）；紫杉醇（Selleck.cn）；MTS試劑及細(xì)胞凍存的DMSO（美國(guó)Sigma?Aldrich公司）；PCR試劑盒、rtPCR試劑盒（Takara公司）；b?Actin（13E5）Rabbit mAb、Bim（C34C5）Rabbit mAb（Cell signaling Tec。）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌細(xì)胞株（MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、BT549）及肺癌細(xì)胞株（HCC2279）用完全培養(yǎng)基（RPMI 1640+10%FBS）于T25的培養(yǎng)瓶中37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每2～3天更換一次培養(yǎng)液，細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)可用于實(shí)驗(yàn)使用。

1.3 檢測(cè)細(xì)胞株中BIM缺失多態(tài)性 運(yùn)用DNA/RNA/Protein Isolation Kit（Omega，Cat R6734）提取各細(xì)胞株中的總DNA/RNA/Protein，再通過PCR技術(shù)（Takara，RR030A）擴(kuò)增目的基因并進(jìn)一步行基因測(cè)序明確目的條帶。PCR引物設(shè)計(jì)：野生型：上游引物5′?CCACCAATGGAAAAGGTTCA?3′，下游引物 5′?CTGTCATTTCTCCCCACCAC?3′，缺失型：上游引物與野生型相同，下游引物5′?GCACAGCCTC?TATGGAGAA?3′。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃7 min終延伸，4℃取出。

1.4 rtPCR檢測(cè)細(xì)胞株的BIM mRNA 吸取上述各細(xì)胞株中提取的總RNA，測(cè)定RNA純度及含量。使用Takara逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara，RR047A）逆轉(zhuǎn)mRNA為cDNA。rtPCR擴(kuò)增以cDNA為模板，按照試劑（Takara，RR420A）說明書進(jìn)行BIM EX?ON3及EXON4變體表達(dá)量的測(cè)定。PCR引物設(shè)計(jì)：EXON3：上游引物 5′?CAATGGTAGTCATCCT?AGAGG?3′，下游引物5′?GACAAAATGCTCAAGGA?AGAGG?3′，EXON4：上游引物 5′?TTCCATGAGGC?AGGCTGAAC?3′，下游引物5′?CCTCCTTGCATAGT?AAGCGTT?3′，EXON2（內(nèi)參）：上游引物5′?ATGG?CAAAGCAACCTTCTGATG?3′，下游引物5′?GGCTC?TGTCTGTAGGGAGGT?3′。反應(yīng)條件：98 ℃預(yù)變性2 min，98℃變性10 s，62℃退火20 s，72℃延伸30 s，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃7 min終延伸，4℃取出。

1.5 Western Blot檢測(cè)細(xì)胞株的功能性BIM蛋白 吸取上述各細(xì)胞株中提取的總蛋白，經(jīng)Nano?Drop ND?2000超微量分光光度計(jì)測(cè)定蛋白濃度后加上樣緩沖液并于沸水使蛋白變性。采用SDS?PAGE電泳的方式分離目標(biāo)蛋白，隨后通過蛋白轉(zhuǎn)印儀半干轉(zhuǎn)法（25 V，3 A，7 min）將其轉(zhuǎn)至PVDF膜。以含5%脫脂牛奶TBST液封閉，再孵育一抗搖床過夜。次日，分別經(jīng)過洗膜、熒光二抗孵育、再次洗膜后，于Odyssey CLx近紅外雙色激光成像系統(tǒng)曝光。

1.6 MTS測(cè)定細(xì)胞株的紫杉醇IC50收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度為50 000個(gè)/mL，每孔加入100 μL細(xì)胞懸液（每孔5 000個(gè)細(xì)胞），置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待貼壁后第2天，加入100 μL用含10%血清的培養(yǎng)基配制的不同濃度梯度的化療藥物（紫杉醇）。繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL?MTS（5 mg/mL），培養(yǎng)3～4 h后終止培養(yǎng)。隨后通過檢測(cè)吸光值，確定各細(xì)胞株對(duì)藥物的IC50值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上，數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩兩比較采用Student′st檢驗(yàn)。P＜0.05定義為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人乳腺癌細(xì)胞株中BIM缺失多態(tài)性的突變情況 T47D與HCC2279均具有BIM缺失多態(tài)性（PCR產(chǎn)物為285及363 bp），與文獻(xiàn)報(bào)道肺癌細(xì)胞株HCC2279的檢測(cè)結(jié)果相一致［5］。而MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435則為BIM野生型乳腺癌細(xì)胞株（PCR產(chǎn)物為363 bp）（圖1）。

圖1 BIM缺失多態(tài)性PCR（A）與基因測(cè)序檢測(cè)結(jié)果（B）Fig.1The PCR detection result（A）and direct sequencing result（B）of Bim deletion polymorphism

2.2 BIM mRNA及功能性BIM蛋白在乳腺癌細(xì)胞株的表達(dá)情況 乳腺癌細(xì)胞株中（MCF7、MDA?MB?231、MDA?MB?435、T47D），BIM mRNA EXON3：EXON4比值在T47D（BIM突變型）中比值較高，而在其余細(xì)胞株中則比值較低（P＜0.05，圖2A）。與此同時(shí)，功能性 BIM 蛋白（BimEL、BimL、BimS）在T47D（BIM突變型）中表達(dá)下調(diào)，而在其余細(xì)胞株中則有較高水平的表達(dá)（P＜0.05，圖2 B）。

2.3 BIM缺失多態(tài)性與紫杉醇敏感性的關(guān)系 本研究選用了乳腺癌常見的Luminal A型（ER、PR陽(yáng)性，HER?2陰性）的T47D（BIM突變型）、MCF?7（BIM野生型）乳腺癌細(xì)胞株作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?1-12］。結(jié)果示BIM突變型細(xì)胞株（T47D，IC50＞30 μmol/L）相對(duì)野生型細(xì)胞株［MCF?7，IC50=（0.16 ± 0.02）μmol/L］對(duì)紫杉醇藥物敏感性顯著較低，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜ 0.05，圖3）。

圖2 各乳腺癌細(xì)胞株BIM mRNA EXON3：EXON4比值（A）與功能性BIM蛋白的表達(dá)情況（B）Fig.2 The ratio of BIM EXON3 to EXON4（A）and the levelof functional BIM protein（B）in breast cancer cell lines

2.4 BIM缺失多態(tài)性與紫杉醇內(nèi)源性耐藥機(jī)制的關(guān)系 在相同紫杉醇濃度作用下，伴隨時(shí)間的變化，采用rtPCR測(cè)定BIM mRNA EXON3：EXON4比值。結(jié)果示T47D（BIM突變型）EXON3：EXON4比值隨紫杉醇作用時(shí)間變化而逐漸增大，MCF?7（BIM野生型）則逐漸減?。≒＜0.05，圖4 A）。同時(shí)，在相同時(shí)間不同濃度紫杉醇作用下，Western Blot測(cè)定T47D的功能性BIM蛋白（BimEL）的表達(dá)較MCF?7逐漸減少（P＜0.05，圖4 B）。

3 討論

BIM是Bcl?2家族成員之一，屬于BH3?only蛋白，是參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要介質(zhì)［13-14］。近期，Ng等通過末端測(cè)序技術(shù)篩查CML患者的基因組時(shí)發(fā)現(xiàn)，BIM在2號(hào)內(nèi)含子中發(fā)生了2 903個(gè)堿基對(duì)的缺失，且該現(xiàn)象在非小細(xì)胞肺癌和慢性髓細(xì)胞白血病中與酪氨酸激酶抑制劑內(nèi)源性耐藥機(jī)制密切相關(guān)［5］。隨后，在乳腺癌及其多種腫瘤類型中發(fā)現(xiàn)BIM缺失多態(tài)性為不良預(yù)后的預(yù)測(cè)因子［6-10］。本研究通過篩查，首次發(fā)現(xiàn)了BIM缺失多態(tài)性乳腺癌細(xì)胞株T47D，且其突變類型與文獻(xiàn)報(bào)道的肺癌細(xì)胞株（HCC2279）相一致［5］。同時(shí)，MTS測(cè)定結(jié)果示，同為L(zhǎng)uminal A型的T47D細(xì)胞株（BIM突變型）較MCF7細(xì)胞株（BIM野生型）對(duì)紫杉醇敏感性顯著較低。這表明BIM缺失多態(tài)性可能參與了紫杉醇的內(nèi)源性耐藥機(jī)制。最近的研究發(fā)現(xiàn)，BIM缺失多態(tài)性會(huì)使得BIM在轉(zhuǎn)錄后選擇性剪切的過程中更傾向于剪切EXON3（編碼終止子/多聚A尾）而非EXON4（編碼BH3同源結(jié)構(gòu)域），導(dǎo)致其所編碼翻譯的蛋白質(zhì)產(chǎn)物Bimγ中只含有動(dòng)力蛋白結(jié)合區(qū)域，卻缺失BH3同源結(jié)構(gòu)域和C端疏水序列，然而BH3同源結(jié)構(gòu)域是BH3?only蛋白中發(fā)揮促凋亡作用的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)［5，15-17］。而在本研究的rtPCR及Western Blot結(jié)果中，T47D（BIM突變型）較其他野生型細(xì)胞株，BIM mRNA EXON3：EX?ON4比值高且功能性BIM蛋白表達(dá)下調(diào)。與此同時(shí)，相對(duì)MCF7（BIM野生型）而言，在紫杉醇作用下T47D（BIM突變型）BIM mRNA EXON3：EXON4比值隨時(shí)間的推移逐漸增高，而功能性BIM蛋白（BimEL）則逐漸下調(diào)。該現(xiàn)象表明，BIM缺失多態(tài)性在乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機(jī)制中的作用可能與Ng等在非小細(xì)胞肺癌中的推斷是相一致的。BIM缺失多態(tài)性在乳腺癌中可通過影響B(tài)IM mRNA選擇性剪切的過程，致使轉(zhuǎn)錄出大量含有EXON3的BIM mRNA，進(jìn)而翻譯出無功能性的BIM蛋白（Bimγ），從而削弱了內(nèi)源性凋亡途徑的作用，使得乳腺癌腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性降低，導(dǎo)致內(nèi)源性耐藥的發(fā)生。其次，最近的研究發(fā)現(xiàn)BH3模擬劑（ABT?737 or ABT?263）［5］和HDAC抑制劑（Vorinostat）［18］具有逆轉(zhuǎn)BIM缺失多態(tài)性所致內(nèi)源性耐藥的作用。前者是模擬了Bad的BH3結(jié)構(gòu)域，而后者則是通過介導(dǎo)啟動(dòng)子區(qū)域的組蛋白乙酰化，促進(jìn)BH3?only蛋白的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，從而克服耐藥發(fā)生。其機(jī)制都是通過增強(qiáng)BH3?only蛋白（Bim、Bid、Bad、Bik）的作用來促進(jìn)內(nèi)源性凋亡途徑，側(cè)面也論證了BIM缺失多態(tài)性可能是通過削弱內(nèi)源性凋亡途徑，從而介導(dǎo)內(nèi)源性耐藥機(jī)制的發(fā)生。

綜上所述，BIM缺失多態(tài)性可能與乳腺癌紫杉醇內(nèi)源性耐藥機(jī)制密切相關(guān)。然而，本研究為細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)，且相關(guān)研究較少，其結(jié)論仍有待細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床觀察的進(jìn)一步論證。

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