梁 薇 ，楊 艷，李曉燕 ，趙 創(chuàng) ，茍小軍

過(guò)敏性鼻炎（AR）是由于鼻腔黏膜發(fā)生變態(tài)反應(yīng)而引起的疾病，所以又稱變應(yīng)性鼻炎[1]，AR為耳鼻喉臨床科常見(jiàn)病、多發(fā)病。近年來(lái)，AR的發(fā)病率呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，全球發(fā)病率為10%～25%[2]，中國(guó) AR 患病率為 8．7%～24．1%[3]。AR 在祖國(guó)醫(yī)學(xué)中屬于“鼻嚏”、“鼻鼽”、“鼽嚏”的范疇?！胺螝馓搫t鼻塞不利”，肺開(kāi)竅于鼻，鼻有賴于肺氣的充養(yǎng)，故肺病可引觸鼻病;腎為先天之本，諸陽(yáng)之根，主納氣。先天稟賦不足，或后天久病傷腎，腎陽(yáng)不足，肺失溫煦，易感外邪。此情況多出現(xiàn)肺脾腎三臟陽(yáng)氣虧虛，寒水上泛而不能制，尤易受風(fēng)寒異氣之刺激而發(fā)病。鼻的正常生理功能的發(fā)揮依賴腎的精氣充養(yǎng)，如果陽(yáng)氣不足，不能溫化水飲，寒濕上泛，則使鼻流清涕，可見(jiàn)腎氣不足，肺失溫養(yǎng)，可導(dǎo)致鼻鼽的發(fā)生。西醫(yī)多采用抗生素或激素治療AR，雖然效果顯著，但不能從根本上解決問(wèn)題；而中醫(yī)采用整體論治和辨證治療AR，療效顯著，并且積累了大量的臨床經(jīng)驗(yàn)，與西醫(yī)相比，有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，但中醫(yī)辨證治療AR存在許多的問(wèn)題，缺乏科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)客觀的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，使得中醫(yī)辨證治療AR的臨床療效不能被很好的證實(shí)，嚴(yán)重制約了中醫(yī)臨床研究與國(guó)際接軌，如何使中醫(yī)辨證治療得到客觀化、可視化，已經(jīng)成為目前中醫(yī)研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

代謝組學(xué)是研究生物體受到刺激或擾動(dòng)后，所有低分子量的代謝產(chǎn)物隨時(shí)空變化的一種組學(xué)方法[4]，是一種整體系統(tǒng)的研究技術(shù)，在方法學(xué)上具有融整體、動(dòng)態(tài)、綜合、分析于一體的特點(diǎn)，與中醫(yī)學(xué)的整體觀念和辨證論治思維模式上存在天然的一致性，兩者均表現(xiàn)的是致病因素與機(jī)體反應(yīng)共同的結(jié)果，為中醫(yī)證候研究提供了新的思路和方法[5]。因此，本研究采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（GC/MS）技術(shù)，進(jìn)行AR患者肺虛感寒證和腎陽(yáng)虧虛證患者血清代謝組學(xué)研究，尋找AR不同中醫(yī)證候患者的血清中特異性代謝產(chǎn)物的變化，有可能為中醫(yī)辨證的客觀化、定量化開(kāi)辟一條新途徑，對(duì)中醫(yī)證候的規(guī)范化、現(xiàn)代化具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 一般資料 所有AR患者均來(lái)自于2016年10—12月上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院針灸門(mén)診患者。本研究患者14例作為肺虛感寒組，其中男8 例，女 6 例，患者平均年齡（44．46±4．94）歲；6 例作為腎陽(yáng)虧虛組，其中男3例，女3例，患者平均年齡（47．55±5．14） 歲；20 例健康人作為對(duì)照組，其中男10 例，女 10 例，平均年齡（46．12±5．63）歲，3 組性別、年齡等基本資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），具有可比性。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2009年中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉頭頸外科學(xué)分會(huì)組制定的《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南》推薦的標(biāo)準(zhǔn)[6]。

1.2.2 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照1994年國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《中醫(yī)病證診斷療效標(biāo)準(zhǔn)》[7]中的肺虛感寒證和腎陽(yáng)虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡18～65歲之間的門(mén)診或住院患者；性別不限；凡符合西醫(yī)AR診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)肺虛感寒證和腎陽(yáng)虧虛證辨證標(biāo)準(zhǔn)，簽署知情同意書(shū)者。

1.2.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并有嚴(yán)重的肝腎功能不全、心臟病、腦血管病、糖尿病等；其他過(guò)敏性疾病患者。

1.3 研究方法

1.3.1 血清采集 叮囑研究對(duì)象在樣本收集前3 d清淡飲食，避免食用海鮮以及辛辣食物，以減少食物對(duì)代謝造成的波動(dòng)。研究對(duì)象集中到門(mén)診，由工作人員抽取早晨空腹的血液5 mL，置于離心管中密封，記錄標(biāo)號(hào)，-4℃冰箱靜置1 h，然后離心，吸取上清液，于-80℃冰箱冷凍保存，待檢測(cè)。

1．3．2 試劑與儀器 BSTFA+1%TMCS，雙三甲硅基三 氟 乙 酰 胺 [N，O-bis（trimethylsilyl）trifluoroacetam ide]，購(gòu)于梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào):B0830；鹽酸甲氧胺（methoxyamine hydrochloride），購(gòu)于梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：M0343；2-氯苯丙氨酸、十七碳酸、吡啶、甲醇皆為分析純，購(gòu)于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（7890A/5975C，安捷倫科技有限公司）；氣相毛細(xì)管色譜柱（HP-5MS，5%苯/95%甲基聚硅氧烷 30 m×250 μmi．d．，0．25 μm film thickness，Agilent J&WScientific，F(xiàn)olsom，CA，USA）；冷凍離心機(jī)（H1650-W，Eppendor f）；混勻儀（QL-866，江蘇海門(mén)其林貝爾儀器制造有限公司）；鼓風(fēng)干燥箱（D HG-9240，Y iHe ng）；真空離心濃縮儀（Eppendorf 53050）。

1.3.3 血清樣品前處理 實(shí)驗(yàn)前2 h，將所有樣本在4℃下融化；取樣本100μL于1．5 mL離心管中，加入400μL甲醇，振蕩60 s，充分混勻；加入60μL十七碳酸（0．2 mg/mL）作為內(nèi)標(biāo)，渦旋振蕩 60 s；在12 000 r/min 4℃離心10 min，取全部上清液轉(zhuǎn)移到新的1．5 mL離心管中，樣品用真空離心濃縮儀濃縮至干；加入60μL鹽酸甲氧胺溶液渦旋振蕩30 s，在37℃條件下反應(yīng)2 h；最后加入60μLBSTFA試劑（雙三甲硅基三氟乙酰胺，含1%三甲基氯硅烷，37℃條件下反應(yīng)90 min，12 000 r/min 4℃離心10 min，取上清液加入到檢測(cè)瓶中。

1.3.4 GC/MS分析條件 色譜及質(zhì)譜參數(shù)如下：系統(tǒng)載氣及流速：進(jìn)樣量1μL，分流比20∶1，氦氣1 mL/min，進(jìn)樣口溫度280℃；離子源溫度230℃；接口溫度150℃；升溫程序以60℃為初始溫度，持續(xù)2 min，以10℃/min的速率上升到300℃并在300℃停留5 min，溶劑延時(shí)5 min；電離方式EI；電子能量70 eV；質(zhì)譜掃描范圍：m/z35-780；全掃描方式。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理與模式識(shí)別方法 原始GC/MS數(shù)據(jù)文件，通過(guò)Agilent MSDChemStation工作站轉(zhuǎn)換成NetCDF格式，然后導(dǎo)入到R3．3的XCMS程序包中進(jìn)行峰識(shí)別、峰過(guò)濾、峰對(duì)齊等過(guò)程，最終得到1個(gè)保留時(shí)間、質(zhì)荷比和峰強(qiáng)度組成的三維矩陣表，將三維矩陣導(dǎo)入 SIMCA-P11．5 軟件（Umetrics，Swed en）中進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析。采用非監(jiān)督的主成分分析（PCA）和監(jiān)督分析法如正交偏最小二乘法（OPLSA）建模，尋找造成樣本聚集和離散的主要差異變量。基于差異表達(dá)的代謝物鑒定，主要是結(jié)合AMDIS程序進(jìn)行，利用National Instituteof Standards and Technology（NIST）商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)和 Wiley Registry代謝組數(shù)據(jù)庫(kù)及本實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)品代謝物譜庫(kù)。

2 結(jié)果

2.1 代謝指紋圖譜宏觀分析 比較正常對(duì)照組、肺虛感寒組和腎陽(yáng)虧虛組樣本的典型血清總離子色譜圖，宏觀上觀察到這3組的代謝指紋圖譜有細(xì)微的差異，主要是峰強(qiáng)度有一定的差異，結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 代謝譜分析 為了觀察所有樣本的大致趨勢(shì)以及樣本的自然分布和組別關(guān)系，發(fā)現(xiàn)聚類(lèi)和奇異點(diǎn)，首先使用非監(jiān)督的P CA，分別分析了正常對(duì)照組、肺虛感寒組和腎陽(yáng)虧虛組的血清代謝譜，結(jié)果顯示，在無(wú)監(jiān)督狀態(tài)下各組血清代謝物譜不能區(qū)分，交叉聚集，結(jié)果見(jiàn)圖2。為了進(jìn)一步篩選AR不同證型分類(lèi)的關(guān)鍵變量，對(duì)各組數(shù)據(jù)進(jìn)行了三維的PLS-DA分析，經(jīng)7次重交叉驗(yàn)證，模型的R2Y=0．71，Q2Y=0．17，分類(lèi)結(jié)果如圖 3 所示。

圖1 血清GC/MS總離子流色譜圖Fig.1 GC/MStotal ion chromatogram of serum

2.3 差異代謝物的分析 基于PLS-DA分析結(jié)果，依據(jù)權(quán)重系數(shù) VIP＞1，相關(guān)系數(shù)的閾值|r|＞0．4，P＜0．05，測(cè)得的差異代謝物，單維上進(jìn)行驗(yàn)證（t-test檢驗(yàn)，P＜0．05），結(jié)合 AMDIS 程序，利用 NIST 商業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)和Wiley Registry數(shù)據(jù)庫(kù)及本實(shí)驗(yàn)室建立的標(biāo)準(zhǔn)品代謝物譜庫(kù)，鑒定了23個(gè)差異代謝物，并進(jìn)行了相對(duì)濃度單維上變化情況的考察，結(jié)果見(jiàn)圖4和表1。

3 討論

圖2 AR肺虛感寒組、腎陽(yáng)虧虛組和正常對(duì)照組血清代謝PCA得分圖Fig.2 Serum metabolic PCA score map of control group，lung deficiency and cold syndrome and kidney-yang deficiency syndrome in AR

本研究采用基于GC/MS技術(shù)的血清代謝組學(xué)方法，進(jìn)行AR患者肺虛感寒證和腎陽(yáng)虧虛證血清代謝譜研究，PLS-DA方法能夠區(qū)分AR肺虛感寒證、腎陽(yáng)虧虛證和正常對(duì)照組的代謝譜，而且這2個(gè)證型之間也可以區(qū)分。經(jīng)多維和單維統(tǒng)計(jì)分析，獲得了丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸等6個(gè)與肺虛感寒證、腎陽(yáng)虧虛證密切相關(guān)的潛在標(biāo)志物，這些標(biāo)志物含有特定的生物學(xué)內(nèi)涵。

首先，血清中找到的與氨基酸代謝有關(guān)的有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的標(biāo)志物是丙氨酸。

丙氨酸在體內(nèi)經(jīng)血液運(yùn)到肝臟，通過(guò)聯(lián)合脫氨基作用生成氨和丙酮酸，丙酮酸經(jīng)糖異生途徑生成葡糖糖，因此，丙氨酸是葡萄糖循環(huán)途徑中的重要參與者與調(diào)控者，其代謝異常與腎小球的濾過(guò)和回收功能有關(guān)[8]。本研究中，肺虛感寒證組的丙氨酸含量比腎陽(yáng)虧虛證組低。說(shuō)明肺虛感寒證組比腎陽(yáng)虧虛證組存在更嚴(yán)重的氨基酸代謝紊亂。

圖3 AR肺虛感寒組、腎陽(yáng)虧虛組和正常對(duì)照組血清代謝PLS-DA得分圖Fig.3 Serum metabolic PLS-DA score map of control group，lung deficiency and cold syndromeand kidneyyang deficiency syndrome in AR

圖4 AR肺虛感寒組、腎陽(yáng)虧虛組和正常對(duì)照組血清代謝V-Plot圖Fig.4 Serum metabolic V-Plot map of control group，lung deficiency and cold syndromeand kidney-yang deficiency syndrome in AR

表l關(guān)鍵代謝物的名稱及其變化Tab.1 Nameof key metabolitesand their changes

本研究還發(fā)現(xiàn)十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸等一些脂肪酸發(fā)生了變化。脂肪酸是最基本的脂質(zhì)成分，主要由脂類(lèi)物質(zhì)的分解產(chǎn)生和其他物質(zhì)的分解轉(zhuǎn)化而成。脂肪酸根據(jù)有無(wú)雙鍵及其數(shù)目，可分為3大類(lèi)：飽和脂肪酸、單不飽和脂肪酸、多不飽和脂肪酸，不同的脂肪酸可能具有不同的作用，可能有的對(duì)機(jī)體起保護(hù)作用，有的對(duì)機(jī)體產(chǎn)生危害[9]。據(jù)報(bào)道，脂代謝異常導(dǎo)致血中脂肪酸增加，而脂肪酸的升高可以通過(guò)溶酶體途徑使腫瘤壞死因子-α（TNF-α）表達(dá)增加，脂肪酸導(dǎo)致Bax易位于溶酶體，組織蛋白酶從溶酶體易位于胞漿，最后溶酶體破裂，核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）降解，釋放出 NF-κB，定位到核內(nèi)，激活 TNF-α 并且 TNF-α、白介素-6（IL-6）與脂肪酸呈正相關(guān)[10-11]。在炎性疾病中TNF-α扮演著重要的角色，特別是AR患者，其鼻黏膜下組織中巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、單核細(xì)胞等數(shù)量均相對(duì)較多，其均可生成TNF-α，因此，AR的發(fā)病與TNF-α有關(guān)系[12]。而IL-6作為細(xì)胞因子，其擁有多功能，其在炎癥反應(yīng)、免疫應(yīng)答等方面均扮演著重要的角色。IL-6是通過(guò)單核、巨噬細(xì)胞等誘導(dǎo)下出現(xiàn)的細(xì)胞因子，可直接激活血管內(nèi)皮細(xì)胞與炎性細(xì)胞，具有一定的毒性，還可促進(jìn)急性期蛋白合成，從而進(jìn)一步增加了炎性反應(yīng)。IL-6能夠調(diào)節(jié)IgE免疫應(yīng)答，還可以上調(diào)黏附分子的表達(dá)，參與多種白細(xì)胞黏附與聚集，也可以加強(qiáng)炎癥反應(yīng)[14]。Omega-3來(lái)自深海魚(yú)油，其主要成分是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA），DHA和EPA主要是通過(guò)PPARα-IκB-NFκB的信號(hào)通路影響炎癥信號(hào)傳遞。EPA或DHA與PPARs結(jié)合后啟動(dòng)抑制蛋白I-κB的基因表達(dá)，在細(xì)胞質(zhì)中I-κB與NF-κB結(jié)合使后者處于非活性狀態(tài)，從而抑制NF-κB介導(dǎo)促炎信號(hào)的傳遞[15]，Omega-3多不飽和脂肪酸能夠抑制炎性細(xì)胞因子的分泌從而降低病理性炎性反應(yīng)[16]，Omega-3能影響脂肪乳劑代謝的中間產(chǎn)物-花生四烯酸的代謝，使其產(chǎn)生前列腺素和系列白三烯產(chǎn)物，從而有助于下調(diào)過(guò)度的炎癥反應(yīng)，促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬功能，改善機(jī)體的免疫機(jī)制[17]。以上研究表明，脂肪酸在AR的發(fā)病中有很重要的作用，本研究中，肺虛感寒證組的十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸含量均比腎陽(yáng)虧虛證組低，說(shuō)明肺虛感寒證組比腎陽(yáng)虧虛證組存在更嚴(yán)重的脂肪酸代謝紊亂。

兩種中醫(yī)證型的共同特點(diǎn)是與氨基酸代謝和脂肪酸代謝異常相關(guān)，反映了機(jī)體在各因素綜合作用下的終端效應(yīng)，是各個(gè)因素效應(yīng)的綜合體現(xiàn)，但是兩種中醫(yī)證型之間又有不同的代謝特點(diǎn)，其中丙氨酸、十四烷酸、十六烷酸、9，12-十八碳二烯酸、9-（Z）-O-十八碳烯酸、十八烷酸的相對(duì)含量在兩種證型間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，使得AR兩證型在臨床鑒別中有了可靠的客觀化及量化的依據(jù)。由此說(shuō)明，本試驗(yàn)使用GC/MS的代謝組學(xué)方法能夠全面反映肺虛感寒證、腎陽(yáng)虧虛證AR患者的代謝共性和各自特征，代謝組學(xué)分析技術(shù)可運(yùn)用于臨床不同中醫(yī)證型的分類(lèi)研究。

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（收稿日期：2017-12-16）