肖澤云 ，李 凱 ，2，李愛秀 ，3

艾滋?。ˋIDS）是由人類免疫缺陷病毒（HIV）引起的一種復雜疾病，其治療一直是醫(yī)學難題。HIV屬于逆轉錄病毒，變異性強，在使用單靶點藥物治療AIDS的過程中，病毒容易產生耐藥[1]。運用網絡藥理學對復雜疾病進行網絡分析，發(fā)現AIDS等復雜疾病由多因素共同作用，其病理過程涉及多個細胞信號分子，僅針對單一細胞信號分子難以起到良好的治療效果。多靶點藥物能夠多途徑調節(jié)疾病的信號通路，同時作用于復雜疾病的多種細胞信號分子，提高治療效果[2-3]。目前，臨床上采用多藥多靶點藥物即“雞尾酒”療法（HAART）治療AIDS。但多藥聯用毒副作用更大，容易引起不良反應，患者的依從性較差[1]。加之病毒交叉耐藥的產生，影響了HAART的治療效果，新型抗HIV藥物的研發(fā)依然緊迫。與多藥多靶點藥物相比，單藥多靶點藥物為單一化學實體，藥代動力學性質更好掌握，并且能夠減少交叉耐藥的發(fā)生。目前，雖然尚未有HIV單藥多靶點抑制劑進入臨床研究階段，但單藥多靶點藥物已成為抗HIV創(chuàng)新藥物的重要思路。

天然產物數量巨大，種類繁多，是研發(fā)新藥和尋找先導化合物的重要來源。目前，在針對AIDS的天然產物研究中，發(fā)現了其中不乏對HIV病毒具有抑制作用的化合物。前期，總結了來源于天然產物的HIV單藥多靶點抑制劑，這些抑制劑按照結構可以分為黃酮類、三萜及其苷類、苯丙素類、蛋白和肽類等，其中數量較多是黃酮類化合物，包括：蛇葡萄素（Ampelop sin)、燈盞花乙素（S cutellarin）、黃芩素（B aicalein）等[4]。這些抑制劑大多是針對HIV整合酶（IN）、逆轉錄酶（RT）和核糖核酸酶 H（RNase H），以作用于IN鏈轉移抑制劑 (INSTI)作用位點和RT非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTI)結合部位的雙靶點抑制劑[RT（N NRTI）/IN]居多。因此，天然產物對于HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑的開發(fā)具有重要意義。

虛擬篩選[5]是指在計算機上，運用分子模擬技術和CADD方法，尋找與受體具有一定親和力的小分子化合物，以提升篩選效率，縮短研發(fā)周期。選擇3-OHHEPT類HIV R T（N NRTI）/IN雙靶點抑制劑[6-7]展開研究，構建針對HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑的分子相似性搜索模型，建立NNRTI和RT以及INSTI和IN對接模型[8-10]，并基于兩種篩選策略分別對TCMD[11]進行虛擬篩選：策略一，先后利用相似性搜索、利平斯基五規(guī)則和分子對接對TCMD逐步篩選，根據分子對接的打分高低排序；策略二，前期研究中基于所建的HIV R T（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑六點藥效團模型和利平斯基五規(guī)則對TCMD進行篩選，得到數據庫TCMD-SearchMD[10]，再基于分子對接對TCMD-SearchMD進行篩選，根據打分高低排序。然后，將這兩種策略篩選出的小分子化合物進行整理分析，以期從中發(fā)現潛在的HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑。

1 材料

1.1 軟件 分子模擬與分子設計軟件包MOE2009．10[12]和 SYBYL8．1[13]。

1.2 數據庫 TCMD2003．1[11]，包括9 127個化合物結構及其相關信息；本研究前期對TCMD篩選得到數據庫TCMD-SearchMD[10]，包括229個化合物結構及其相關信息。

1.3 受體結構 從蛋白數據庫（PDB）下載1JLA[14]，為RT與HEPT類NNRTITNK-651的復合物晶體結構，實驗室基于IN與5ClTEP復合物晶體結構1QS4 構建的理論模型 1QS4（2Mg2+）[15]。

2 方法

2.1 分子相似性搜索模型的構建 本研究分別選擇 TNK-651[16]和已知 3-OH HEPT類 HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑[6-7]中活性較高的化合物1、2（見表1）為模板分子，在MOE相似性搜索模塊分別設定相似性系數（Tani moto coefficient）為45%、50%和60%，對TCMD進行篩選，比較不同相似性系數命中的化合物，進而確定模板分子和對應的相似性系數。Molecular fingerprinting計算方法設定為MACCS，Force field 為 MMFF94x。

2.2 構建分子對接模型

2.2.1 配體準備 分別將配體分子TNK-651和5ClTEP從1JLA和1Q S4（2Mg2+）中抽提出來，在SYBYL配體結構準備模塊（li gand structure preparatio n）對配體分子進行加氫和能量優(yōu)化。參數Force field選擇 Tripos，Method 為 Powell，Termination 為 Gardient 0．001 kcal/（mol·?），Max Iterations為10 000。

2.2.2 受體準備 受體準備在SYBYL Surflex-Dock蛋白結構準備模塊(prepare protein structure)完成，首先將1JLA和1QS4（2Mg2+）配體分子TNK-651和5ClTEP抽提出來，保留A鏈，刪除結晶水，對氨基酸殘基進行加氫。然后，分別以1JLA和1QS4（2Mg2+）中配體的坐標為中心生成Protomol即結合口袋，保存結果用于后續(xù)研究。

表1 模板化合物的結構及活性數據Tab.1 Structureand activity data of templatecompounds

2.2.3 分子對接 為確定RT和NNRTI以及IN和INSTI最佳對接參數，在SYBYLSurflex-Dock模塊，將配體分子TNK-651和5ClTEP分別對接回RT和IN活性位點。選擇標準模式對接，設定TNK-651的結晶構象和5ClTEP結合構象為參比分子。調整對接參數設置，使配體分子對接構象最大程度重現復合物結構中配體分子原構象。一般以配體分子對接構象與復合物中結晶構象之間的均方根偏差（RMSD）值作為判斷標準，當 RMSD≤2．0? 時，對接能夠較好地重現出原配體分子的空間位置及構象。

2.3 數據庫搜索 TCMD庫中包含9 127個化合物，為加快篩選速度，提高陽性率，制定兩種篩選策略[17]。策略一：（1）運用構建的分子相似性搜索模型對TCMD進行篩選，設定化合物2為模板化合物，相似性系數為50%。（2）利用利平斯基五規(guī)則進行類藥性分析。（3）將（2）篩選得到的化合物分別與RT和IN活性口袋對接。策略二：將TCMDSearchMD中化合物分別與RT和IN活性口袋對接，對接采用篩選模式，參數設置與上文2．2一致。

3 結果

3.1 分子相似性搜索模板分子和相似性系數 在構建分子相似性搜索模型的過程中，分別以TNK-651和化合物1、2為模板分子，選擇相似性系數為60%、50%、45%對TCMD進行搜索，結果顯示，比較發(fā)現當相似性系數為50%時，命中化合物的數量適中，用于下一步分子對接篩選。而化合物2活性較高，且對RT和IN抑制活性更為均衡。綜合考慮，本研究選擇以化合物2為模板分子，相似性系數為50%的分子相似性搜索結果用于后續(xù)研究。見表2。

表2 模板分子相似性搜索結果Tab.2 Similarity search results of template compounds

3.2 分子對接模型和參數 本研究分別構建NNRTI和RT活性位點以及INSTI和IN活性位點對接模型，通過調整對接參數，使配體和酶達到最合理的相互作用。結果顯示，TNK-651與RT對接得分為10.60，對接構象與1JLA中結晶構象空間距離的RMSD值為0.977?。5ClTEP與IN對接得分為3.98，對接構象與1QS4（2Mg2+）中原構象空間距離的RMSD值為1.187??？梢钥闯?，空間距離的RMSD值均在2?以下，提示對接構象比較完整地重現了配體分子原構象的空間位置，程序適用，參數設置合理。對接參數設置如下：Maxconformationsper Fragment為 20，Minimum RMSD Between Final Poses 為0.05?，Maximum Number of Poses per Ligand 為 20。

3.3 篩選結果

3.3.1 基于策略一的篩選結果 本研究將相似性搜索命中的152個化合物利用利平斯基五規(guī)則篩選，命中100個小分子。100個小分子中51個與IN對接打分大于4，有43個與RT對接打分大于4，與IN和RT對接打分均大于4的有28個。其中，與IN對接打分大于6的有8個，與RT對接打分大于6的有14個，與IN和RT對接打分均在6以上的有7個。見表3。

3.3.2 基于策略二的篩選結果 將TCMDSearchMD中小分子分別與IN和RT進行對接，與IN對接打分在4以上的有158個，與RT對接打分在4以上的有195個，與IN和RT對接打分均大于4的有143個；其中，與IN對接打分在6以上的有47個，與RT對接打分在6以上的有121個，與IN和RT對接打分均大于6的小分子有29個。見表4。

表3 基于策略一篩選命中的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑Tab.3 Thedoubletarget inhibitor of RT(NNRTI)/IN against HIV based on strategy onescreening hit

3.3.3 綜合篩選結果和理論驗證 綜合篩選結果，除去1個相同的生物堿類化合物M7351，得到35個潛在 HIV R T（N NRTI）/IN雙靶點抑制劑，與 RT和IN對接得分均大于6，對抑制劑的結構類型進行總結，包括黃酮類（15個）、生物堿類（8個）、多酚類（3個）、苯丙素類（3個）、苷類（3個）、有機酸類（2個）和醌類（1個），黃酮類化合物占到了42.86%，包括蛇葡萄素、麝香草素、車前子苷等，而策略一對TCMD篩選命中的7個化合物全部為生物堿類。與RT和IN對接結合較好的化合物蛇葡萄素結構如圖 1（a）所示，圖 1（b，c）為其與 RT 活性位點相互作用2D、3D示意圖，可以看出除疏水相互作用外，蛇葡萄素糖環(huán)3-OH與Lys101、Lys103之間形成氫鍵相互作用，糖環(huán)1-位苯環(huán)與Tyr188之間形成π-π相互作用。觀察蛇葡萄素與IN活性位點相互作用[見圖 1（d、e）]，可以看出其與 IN 之間除存在疏水相互作用和氫鍵相互作用外，還通過氨基酸殘基Asp64和Asp116共同與雙Mg2+發(fā)生金屬離子螯合作用。

4 討論

不同的篩選方法具有各自的針對性和優(yōu)缺點，每種方法均有可能漏篩。本研究通過兩種策略對TCMD進行篩選，每種策略既可以篩選到相同的化合物，也可以篩選到不同的化合物。采用兩種策略，能夠相互補充，避免漏篩。TCMD庫包含9 127個化合物，本研究首先采用相似性搜索和藥效團篩選，接著運用利平斯基五規(guī)則分析，得到的小分子分別與RT和IN進行對接，最終保留潛在的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑。已有研究表明，利用Surflex-Dock程序進行分子對接，打分＞4時配體與受體之間存在較強的相互作用，打分＞6則可以預測配體對受體的抑制活性達微摩爾級。為加快新藥發(fā)現的速度和減少不必要的浪費，本研究優(yōu)先選擇與RT和IN對接打分均大于6的化合物進行分析，以確定率先展開實驗研究的化合物。從數量上看，命中的黃酮類化合物占到了42．86%，是開發(fā)潛在HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑的主要來源，與文獻報道天然產物中HIV RT（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑中黃酮類化合物居多一致。

表4 基于策略二篩選命中的HIV RT(NNRTI)/IN雙靶點抑制劑Tab.4 Doubletarget inhibitor of RT(NNRTI)/IN against HIV based on strategy two screening hit

本研究的篩選結果與其他研究者實驗研究也有契合點，如實驗表明杜仲提取物能夠抑制HIVgp41六螺旋結構的形成，是潛在的HIV抑制劑[18]，本研究篩選得到來源于杜仲的酚類化合物Koaburaside，Koaburaside具有潛在的HIV RT和IN抑制活性，可能是杜仲提取物抗HIV的物質基礎?？鄥⒅械狞S酮類化合物苦參新醇H（K ushenol H）具有弱抗單純性皰疹病毒HSV-1和HSV-2活性[19]，本研究篩選結果顯示其與HIV RT和IN對接打分均大于6，預測對RT和IN抑制活性在微摩爾級。此外，化合物蛇葡萄素能抑制HIV的感染，還能干擾HIV對CD4+細胞的黏附[20]，本研究對接結果表明蛇葡萄素與RT和IN結合較好，并與活性位點之間形成了關鍵相互作用，表明其可能是通過作用于HIV RT和IN，發(fā)揮抗HIV活性。

圖1 蛇葡萄素結構式(a)；與RT相互作用2D圖(b)；與RT相互作用3D圖(c)；與IN相互作用2D圖(d)；與IN相互作用3D圖(e)Fig.1 Structure of Ampelopsin(a);2D diagram of the interaction of Ampelopsin with RT(b);3D diagram of the interaction of Ampelopsin with RT(c);2D diagram of the interaction of Ampelopsin with IN(d);3D diagram of the interaction of Ampelopsin with IN(e)

綜上，本研究運用分子模擬技術和CADD方法構建了針對TCMD的虛擬篩選模型和策略，檢出35個潛在的HIV R T（NNRTI）/IN雙靶點抑制劑，為天然產物來源的HIV雙靶點藥物研發(fā)提供了理論基礎和發(fā)展方向。

參考文獻：

[1]Obermeier M，Ehret R，Wienbreyer A，et al．Resistance remains a problem in treatment failure[J]．Journal of the International AIDS Society，2014，17(4):161-162．

[2] 李愛秀．多靶點藥物的研究及篩選策略的提出[J]．武警后勤學院學報:醫(yī)學版，2013，22(11):1030-1034．

[3] 展 鵬，劉新泳，李 瀟，等．抗艾滋病藥物設計新策略:多靶點及多價態(tài)結合配體[J]．中國藥物化學雜志，2013，23(5):406-416．

[4] 李 凱，李愛秀，靳玉瑞，等．天然產物來源的抗HIV-1多靶點抑制劑研究進展[J]．中草藥，2015，46(12):1840-1848．

[5] 葉德泳．藥物設計學[M]．北京:高等教育出版社，2015:8．

[6]Tang J，Maddali K，Dreis CD，et al．6-Benzoyl-3-hydroxypyrimidine-2，4-diones as Dual Inhibitors of HIV Reverse Transcriptase and Integrase[J]．Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters，2011，21(8):2400-2402．

[7]Tang J，Maddali K，Dreis CD，et al．N-3 nydroxylation of pyrimidine-2，4-diones yields dual inhibitors of HIV reverse transcriptase and integrase[J]．Acs Medicinal Chemistry Letters，2011，2(1):63-67．

[8] Islam MA，Pillay TS．Exploration of the structural requirements of HIV-proteaseinhibitorsusingpharmacophore，virtual screeningand molecular docking approaches for lead identification[J]．Journal of Molecular Graphics&Modelling，2015，56(2):20-30．

[9]Wu KZ，Li AX，Liu XT，et al．Building the pharmacophore model of HIV-1 integrase strand transfer inhibitors and studying their inhibition mechanism[J]．Chinese Journal of Chemistry，2010，29(4):575-581．

[10]肖澤云，李 凱，李愛秀，等．新型HIV逆轉錄酶和整合酶雙靶點抑制劑的虛擬篩選[J]．中國醫(yī)藥導報，2017，14(27):4-7．

[11]周家駒，謝桂榮，嚴新建．中藥原植物化學成分手冊[M]．北京:化學工業(yè)出版社，2004:9．

[12]朱瑞新．計算機輔助藥物設計:基本方法原理概要與實踐詳解[M]．大連:大連理工大學出版社，2011．

[13]Belekar V，Shah A，Garg P．High-throughput virtual screening of phloroglucinol derivatives against HIV-reverse transcriptase[J]．Molecular Diversity，2013，17(1):97-110．

[14]Ren J，Nichols C，Bird L，et al．Structural mechanisms of drug resistance for mutations at codons 181 and 188 in HIV-1 reverse transcriptaseand theimproved resilience of second generation nonnucleosideinhibitors[J]．Journal of Molecular Biology，2001，312(4):795-805．

[15]吳可柱，李愛秀，繆有盼，等．HIV-1整合酶四聚體結構模擬及其活性位點分析[J]．中國生物化學與分子生物學報，2009，25(6):549-555．

[16]孟 歌，陳芬兒．HEPT類HIV-1逆轉錄酶抑制劑的研究進展[J]．中國藥物化學雜志，2004，14(1):56-64．

[17]Distinto S，Esposito F，Kirchmair J，et al．Identification of HIV-1 reverse transcriptase dual inhibitors by a combined shape-，2D-fingerprint-and pharmacophore-based virtualscreeningapproach[J]．European Journal of Medicinal Chemistry，2012，50(50):216-229．

[18]呂 琳，孫燕榮，徐 偉，等．杜仲提取物抗HIV活性成分的分離鑒定[J]．中藥材，2008，31(6):847-850．

[19]Woo ER，Hwak JH，Kim HJ，et al．A new prenylated flavonol from therootsof Sophoraflavescens[J]．Journal of Natural Products，1998，61(12):1552-1554．

[20]Liu DY，Ye JT，Yang WH，et al．Ampelopsin，a small molecule inhibitor of HIV-1 infection targeting HIV entry[J]．Biomedical and Environmental Sciences，2004，17(2):153-164．