朱永久，吳興兵，何勇鳳，楊德國(guó)

(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，農(nóng)業(yè)部淡水生物多樣性保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430223)

長(zhǎng)鰭吻 (Rhinogobioventralis)，俗稱土耗兒，隸屬于鯉形目鯉科 亞科吻 屬，為長(zhǎng)江上游特有種。主要分布于長(zhǎng)江上游干流及雅礱江、烏江等支流中，其個(gè)體小，生長(zhǎng)較慢，喜生活于河流底層。在上世紀(jì)80年代的長(zhǎng)江上游干流及烏江下游捕撈漁業(yè)中為重要經(jīng)濟(jì)魚類，在漁獲物中占比達(dá)8.5%～18.4%[1]。近年來(lái)，由于長(zhǎng)江上游生態(tài)環(huán)境的變化，其資源量呈下降趨勢(shì)，亟待加強(qiáng)保護(hù)[2-4]。目前，長(zhǎng)江上游的多個(gè)魚類增殖放流站已將其列為計(jì)劃放流品種之一，同時(shí)，長(zhǎng)江上游水電設(shè)施配套建設(shè)的魚類增殖放流站由于受到建設(shè)場(chǎng)地和放流規(guī)模的限制，增殖放流站多為循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)。由于缺乏系統(tǒng)的基于循環(huán)水養(yǎng)殖條件下的規(guī)模化人工繁殖技術(shù)支撐，致使該品種的放流計(jì)劃難以實(shí)施。

目前，我國(guó)學(xué)者對(duì)長(zhǎng)鰭吻 的研究主要集中在資源調(diào)查與評(píng)估、年齡與生長(zhǎng)、生物學(xué)及遺傳多樣性和人工繁育等方面[5-14]，有關(guān)長(zhǎng)鰭吻 在封閉循環(huán)水系統(tǒng)中的親魚培育、人工催產(chǎn)和孵化技術(shù)研究，未見文獻(xiàn)報(bào)道。作者于2012年6月—2015年5月，在室內(nèi)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)中進(jìn)行了長(zhǎng)鰭吻 親魚培育、人工催產(chǎn)和孵化技術(shù)研究，以期為長(zhǎng)江上游各魚類增殖站進(jìn)行長(zhǎng)鰭吻 苗種生產(chǎn)提供技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚和養(yǎng)殖設(shè)施

實(shí)驗(yàn)魚全部為長(zhǎng)江瀘州江段收集的野生長(zhǎng)鰭吻 ，規(guī)格110.2～215.2 g。養(yǎng)殖設(shè)施為室內(nèi)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)，共16個(gè)養(yǎng)殖池，養(yǎng)殖水體總體積60 m3，水處理系統(tǒng)由微濾機(jī)、儲(chǔ)水槽、生物過(guò)濾器、紫外消毒單元、溫控和純氧增氧單元組成。該養(yǎng)殖系統(tǒng)于2011年建成，經(jīng)過(guò)6個(gè)月的熟化和試運(yùn)行后，2012年6月開始引進(jìn)野生長(zhǎng)鰭吻 進(jìn)行親魚培育實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)在其中的6個(gè)直徑2 m圓形池中進(jìn)行，水深1 m。

1.2 親魚培育

將收集的野生長(zhǎng)鰭吻 在江邊的船體網(wǎng)箱中暫養(yǎng)1周后，運(yùn)至室內(nèi)封閉循環(huán)水養(yǎng)殖系統(tǒng)進(jìn)行培育。各年度親魚培育具體放養(yǎng)情況和收獲情況見表1，2012年6月—2013年4月培育期間，8#和6#2個(gè)養(yǎng)殖池為單養(yǎng)模式，4#養(yǎng)殖池為混養(yǎng)模式，2013年5月—2015年4月培育期間，各池均采用混養(yǎng)模式?；祓B(yǎng)模式池中除放養(yǎng)長(zhǎng)鰭吻 外，還套養(yǎng)有圓口銅魚(Coreiusguichenoti)、四川裂腹魚(Schizothoraxkozlovi)和紅鯽(Carassiusauratus)等，每池的總放養(yǎng)密度小于10 kg/m3。親魚培育期間，室內(nèi)白天照度平均值87.6 lx，自然光周期，池中水體交換量為1.9 m3/h，水質(zhì)各參數(shù)變動(dòng)范圍pH 7.17～7.40、溶解氧9.27～10.86 mg/L、氨態(tài)氮0.01～0.59 mg/L、亞硝酸鹽氮0.01～0.143 mg/L、硝酸鹽氮4.93～11.03 mg/L。養(yǎng)殖池水溫參考長(zhǎng)江瀘州江段自然水溫，由養(yǎng)殖系統(tǒng)的溫控設(shè)備按圖1節(jié)律控制。投喂飼料為浮性顆粒飼料，粒徑2.0 mm，其營(yíng)養(yǎng)成分為粗蛋白40%、粗脂肪5%、灰分16%。每天投喂2次，投喂時(shí)間為每日16:00和21:00，日投喂量為魚體重的2%。

1.3 親魚性別和成熟度鑒別方法

在繁殖季節(jié)，親魚性別鑒定主要觀察體表特征，即雄魚胸鰭有白色珠星、手感粗糙，而雌魚胸鰭光滑。親魚性腺成熟度采用B超和挖卵檢查結(jié)合的方法，成熟度較好的雌性個(gè)體腹部膨大、松軟，B超影像顯示卵巢組織占整個(gè)腹部的比例較高，卵粒清晰，排布均勻，挖卵檢查，卵粒飽滿，有彈性，光澤度好，經(jīng)透明液處理后，卵核發(fā)生偏移。成熟度好的雄性個(gè)體可擠出乳白色精液，遇水即散。

1.4 人工催產(chǎn)

為篩選適宜的催產(chǎn)劑，進(jìn)行了不同外源激素對(duì)長(zhǎng)鰭吻 催產(chǎn)效果的比較試驗(yàn)。設(shè)置A、B、C、D 4種不同的催產(chǎn)劑處理組，A為鯉魚腦垂體(PG)、B為絨毛膜促性腺激素(HCG)、C為促黃體素釋放激素類似物(LRH-A2)、D為L(zhǎng)RH-A2+地歐酮(DOM)，分別對(duì)6組長(zhǎng)鰭吻 進(jìn)行催產(chǎn)，比較催產(chǎn)率、受精率和孵化率，分組情況及注射劑量見表2。各組催產(chǎn)劑用0.7%氯化鈉溶液稀釋后，采用一針注射法從胸鰭基部注入魚體內(nèi)。

1.5 授精和孵化

授精方法為干法人工授精。采用同一批受精卵進(jìn)行了不同水溫的孵化實(shí)驗(yàn)，以比較不同水溫孵化效果，篩選合適孵化水溫。實(shí)驗(yàn)設(shè)置14、16、18、20、22 ℃ 5個(gè)溫度組，每組3個(gè)重復(fù)，溫度控制采用5組小型封閉循環(huán)水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，控制精度±0.5 ℃。孵化器皿為方形玻璃孵化槽，規(guī)格長(zhǎng)25 cm×寬10 cm×高15 cm，水深10 cm，放卵密度80粒/L，孵化槽分別在5組溫度的水池中水浴控溫，采用定期換水孵化方式，每2 h等溫?fù)Q水50%。定期統(tǒng)計(jì)各發(fā)育階段的存活率。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 親魚培育結(jié)果

由表1可知，2012年6月—2013年4月培育期間，單養(yǎng)模式的8、6號(hào)養(yǎng)殖池的存活率為0，其分別在養(yǎng)殖到94 d和36 d時(shí)全部死亡，主要原因?yàn)楦腥拘」舷x病，而混養(yǎng)模式的4號(hào)養(yǎng)殖池長(zhǎng)鰭吻 存活率為100%，每尾平均增重29.4 g。2013年5月—2015年4月放養(yǎng)全部為混養(yǎng)模式，每個(gè)養(yǎng)殖池均獲得一定數(shù)量的成熟個(gè)體，各池存活率和成熟率的變動(dòng)范圍分別為33.8%～100%和9.1%～100%，每尾平均增重范圍20.6～39.5 g。由圖1計(jì)算可得，3個(gè)培育周期(每年5月—翌年4月)的平均積溫6 266.9 ℃·d(6 115.9～6 460.4 ℃·d)，溫度變化范圍6.4～24.0 ℃。結(jié)果表明，在封閉循環(huán)水系統(tǒng)中，長(zhǎng)鰭吻 親魚培育宜采用混養(yǎng)模式。

表1 2012—2015年封閉循環(huán)水系統(tǒng)長(zhǎng)鰭吻 親魚培育放養(yǎng)與收獲Tab.1 Results from brood stock rearing of R.ventralis in the recycle culture system from 2012 to 2015

圖1 2012-2015年長(zhǎng)鰭吻 親魚培育池水溫變化圖Fig.1 Water temperature of the tanks for brood stocks rearing of R.ventralis from 2012 to 2015

2.2 不同外源激素的催產(chǎn)效果

由表2可知，4個(gè)不同處理組的催產(chǎn)效果為D>A>B>C，其中D組催產(chǎn)率和受精率最高，分別為88.3%和76.4%，且效應(yīng)時(shí)間最短，為23.4 h，A組的孵化率最高，為75.3%。結(jié)果表明，常規(guī)使用劑量下，PG和 HCG單獨(dú)使用均能使長(zhǎng)鰭吻 產(chǎn)卵、受精，LRH-A2單獨(dú)使用不能使長(zhǎng)鰭吻 產(chǎn)卵，而LRH-A2+DOM組合使用時(shí)，能使長(zhǎng)鰭吻 產(chǎn)卵、受精，且催產(chǎn)效果最好。

2.3 水溫對(duì)孵化效果的影響

結(jié)果顯示，5個(gè)孵化溫度組中，14 ℃組長(zhǎng)鰭吻 受精卵發(fā)育至胚孔封閉期時(shí)停止發(fā)育，16、18、20和22 ℃組則均能孵化出苗，且胚胎發(fā)育進(jìn)程隨溫度的升高逐漸加快，孵化時(shí)間(H)與溫度(T)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系(H=0.573T2-30.393T+418.178，R2=0.982，P<0.01)。由表3可知，18 ℃和20 ℃組的孵化率分別為54.27%和56.07%，顯著高于16 ℃和22 ℃組(P<0.05)，而18 ℃和20 ℃組無(wú)顯著差異(P>0.05)。胚胎發(fā)育各溫度范圍的Q10值見表4，其變動(dòng)范圍為3.61～10.47，溫度在18～20 ℃時(shí)Q10值最小，為3.61。

表2 不同外源激素對(duì)長(zhǎng)鰭吻 的催產(chǎn)效果Tab.2 Effects of exogenous hormones on induced spawning in R.ventralis

表3 不同溫度條件下長(zhǎng)鰭吻 受精卵的孵化效果Tab.3 Effects of temperature on the hatching time and hatching rate of the fertilized eggs of R.ventralis

注：同列數(shù)據(jù)上標(biāo)字母不同者表示有顯著差異(P<0.05)

表4 胚胎發(fā)育各溫度范圍的Q10Tab.4 Q10 of embryonic development at different temperatures

2.4 親魚繁殖力

成熟長(zhǎng)鰭吻 雄魚催產(chǎn)后能擠出精液量較少，平均值為0.9 mL/尾(0.3～1.2 mL/尾)，精子快速運(yùn)動(dòng)時(shí)間平均31 s(15～47 s)，壽命55 s(50～97 s)。雌魚平均產(chǎn)卵量5 086 粒/尾(1 760～10 240粒/尾)，相對(duì)產(chǎn)卵量31 粒/g(16～53粒/g)，雌魚產(chǎn)卵量(N)與體重(W)呈顯著正相關(guān)(N=1 353.8+23.7W，R2=0.18，P<0.05)。

圖2 長(zhǎng)鰭吻 產(chǎn)卵量與體重關(guān)系Fig.2 Relationship between spawning amount and body weight of female R.ventralis

3 討論

3.1 長(zhǎng)鰭吻 親魚培育的關(guān)鍵技術(shù)

親魚培育是魚類人工繁殖的重要技術(shù)環(huán)節(jié)，人工條件下培育一定量的成熟親魚是長(zhǎng)鰭吻 人工繁殖生產(chǎn)的物質(zhì)基礎(chǔ)。江河捕撈的野生長(zhǎng)鰭吻 在封閉循環(huán)水系統(tǒng)中易感小瓜蟲病，較難存活。本研究采用混養(yǎng)模式進(jìn)行長(zhǎng)鰭吻 親魚培育，能顯著提高其存活率，最高可達(dá)100%。其原因在于長(zhǎng)鰭吻 喜集群，在單養(yǎng)模式下極易導(dǎo)致小瓜蟲病的傳播，而混養(yǎng)模式培育池中的長(zhǎng)鰭吻 不易成團(tuán)結(jié)群，在整個(gè)培育期內(nèi)未感染小瓜蟲病。

水溫也是親本培育的關(guān)鍵因素。魚類是變溫動(dòng)物，溫度是影響魚類性腺發(fā)育的重要環(huán)境因子，魚類自然棲息地水體的溫度變化是有規(guī)律的，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的演化和生態(tài)適應(yīng)，不同種魚在整個(gè)生殖周期中對(duì)溫度的要求各不相同[15]。本研究通過(guò)模擬長(zhǎng)鰭吻 自然棲息地的溫度條件，在可調(diào)溫封閉循環(huán)水系統(tǒng)，控制培育池周年溫度變化節(jié)律，能使其性腺發(fā)育達(dá)到生長(zhǎng)成熟，并借用外源激素成功進(jìn)行人工催產(chǎn)。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，曾觀察到個(gè)別性成熟長(zhǎng)鰭吻 雌魚在循環(huán)水系統(tǒng)的微流水條件下也能達(dá)到生理成熟，有自行排卵現(xiàn)象，說(shuō)明在該環(huán)境條件下，無(wú)需外源激素，其卵也能發(fā)育至第Ⅴ時(shí)相，但未發(fā)現(xiàn)自然交配產(chǎn)卵現(xiàn)象。除水溫外，營(yíng)養(yǎng)、光照、流速和養(yǎng)殖密度等都可能對(duì)長(zhǎng)鰭吻 的生長(zhǎng)和性腺發(fā)育產(chǎn)生影響，有待更進(jìn)一步研究。

3.2 不同外源激素對(duì)長(zhǎng)鰭吻 催產(chǎn)的敏感性

不同外源激素對(duì)魚的作用機(jī)理不同，作用途徑和靶點(diǎn)存在差異，導(dǎo)致不同種魚對(duì)不同外源激素的敏感性存在差異[16]，如草魚(Ctenopharyngodonidella)對(duì)LRH-A2敏感，鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)、鳙(Aristichthysnobilis)對(duì)HCG敏感[17]，本研究顯示長(zhǎng)鰭吻 對(duì)PG、HCG和LRH-A2+DOM合劑較為敏感，對(duì)常規(guī)劑量(10 μg/kg)單一LRH-A2不敏感，且LRH-A2+DOM合劑對(duì)長(zhǎng)鰭吻 催產(chǎn)效果最好，因此在生產(chǎn)上，建議使用LRH-A2+DOM組劑作為催產(chǎn)劑。

3.3 溫度對(duì)長(zhǎng)鰭吻 胚胎發(fā)育的影響

水溫是影響魚類胚胎發(fā)育和孵化時(shí)間的重要因素之一[18]，在一定溫度范圍內(nèi)，水溫越高，魚類胚胎發(fā)育速度越快，孵化時(shí)間越短[19-21]。本研究結(jié)果表明，在16～22 ℃溫度條件下，隨著溫度的升高，長(zhǎng)鰭吻 胚胎發(fā)育速度加快，且孵化時(shí)間與水溫呈顯著負(fù)相關(guān)，符合上述普遍規(guī)律。Q10值是溫度對(duì)胚胎發(fā)育速度影響的量化值，一般認(rèn)為Q10在2左右的溫度帶為較適宜的胚胎發(fā)育溫度[19]。由本實(shí)驗(yàn)4個(gè)溫度組孵化時(shí)間計(jì)算出來(lái)的Q10值為3.61～10.47，其中18-20 ℃時(shí)的Q10為3.61，為4組溫度中最小值，較接近2。而且謝仰杰等[20]和Mihelakakis等[22]認(rèn)為，胚胎發(fā)育適宜溫度范圍還可以孵化率達(dá)到50%為標(biāo)準(zhǔn)，本研究中18 ℃和20 ℃組的孵化率均大于50%，因此，綜合考慮Q10值和孵化率，可以認(rèn)定長(zhǎng)鰭吻 受精卵的適宜孵化溫度為18～20 ℃。

致謝：本組前同事郭威和研究生姚建偉、李飛、李昊成、許德高、王旭歌參加了部分實(shí)驗(yàn)工作，在此一并致謝。

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