張永剛，欒林林，任 海，葛慕湘，靳曉敏，葉仕根

(1.大連海洋大學(xué)，農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連 116023；2.河北科技師范學(xué)院，河北省預(yù)防獸醫(yī)學(xué)重點實驗室，河北昌黎 066600)

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，特別是高密度養(yǎng)殖技術(shù)的推廣，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物疾病時有爆發(fā)，為魚類疾病防治提出了新的問題[1]。哈維氏弧菌(Vibrioharveyi)是一種革蘭氏陰性發(fā)光細菌，廣泛存在于海洋環(huán)境與水產(chǎn)動物的體內(nèi)外[2]，是水產(chǎn)養(yǎng)殖動物的重要致病菌。該菌可感染魚、蝦和貝類等重要水產(chǎn)經(jīng)濟動物[3]，在澳大利亞、厄瓜多爾及中國等國家均有發(fā)生[4-6]，給海水養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。

中草藥不僅具有綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性及性能多樣化的優(yōu)點，還具有預(yù)防疾病發(fā)生和提高非特異性免疫力等功效[7]。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，中草藥使用廣泛，對細菌性、病毒性、寄生蟲性疾病都有相應(yīng)的配方并具有良好的效果[8-9]。因此，應(yīng)用中草藥防治魚病越來越受到人們的關(guān)注。本試驗選取石榴皮、五倍子和大黃等18種常見中草藥開展了哈維氏弧菌的體外抑菌作用，從中篩選出對哈維氏弧菌有較好抑制作用的中草藥，旨在為該菌引起的爆發(fā)性魚病的防治工作提供依據(jù)，并為開發(fā)中草藥應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的疾病防控提供思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

試驗用菌(編號：HQ150310-1)由河北科技師范學(xué)院重點實驗室提供，分離自患病大菱鲆的肝臟，經(jīng)回歸感染試驗確認(rèn)為其致病菌，經(jīng)形態(tài)特征、理化特性及16S rRNA基因序列測定鑒定為哈維氏弧菌，菌株于-80 ℃甘油中保藏。將該菌轉(zhuǎn)接于營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24 h ，再用肉湯培養(yǎng)基28 ℃培養(yǎng)24 h后用無菌生理鹽水稀釋至1.5×108CFU/mL菌懸液備用。

1.1.2 試驗用藥

用于實驗的中草藥:五倍子(Rhuschinensis)、大黃(Rheumpalmatum)、魚腥草(Houttuyniacordata)、石榴皮(Pericarpiumgranati)、穿心蓮(Andrographispaniculata)、烏梅(Darkplumfruit)、沙棘(Hippophaerhamnoides)、公丁香(Syzygiumaromaticum)、辣蓼(Persicariahydropiper)、甘草(GlycyrrhizauralensisFisch)、陳皮(Pericarpiumcitrireticulate)、薄荷(MenthahaplocalyxBriq)、黃柏(Phellodendronchinense)、桉樹葉(Eucalyptusrobusta)、黃連(Coptischinensis)、石菖蒲(Acorustatarinowii)、馬齒莧(Portulacaoleracea)、蘇木(Caesalpiniasappan)。這18種中草藥均購自安國市神禾中藥材飲片有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

普通營養(yǎng)瓊脂(批號為140811)、肉湯培養(yǎng)基(批號為CM106)，均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 方法

1.2.1 中草藥原液的制備

18種中草藥各取100 g，各加入500 mL 的蒸餾水浸泡1 h，加熱煮沸60 min，藥汁經(jīng)4層紗過濾后倒出藥液，將藥渣再各加入500 mL 的蒸餾水，加熱煮沸60 min，過濾后倒出藥液，將兩次藥液合并蒸發(fā)濃縮到100 mL 即制成藥物濃度為1 g/mL的中草藥原液。經(jīng)過高壓滅菌121 ℃15 min后，將無菌藥液置于冰箱中冷藏備用[10]。

1.2.2 藥敏紙片的制備

用打孔器將定量濾紙片制成直徑為6 mm的濾紙圓片，裝入直徑60 mm的平皿中，120 ℃干熱滅菌2 h后備用。將制備好的稀釋藥液注入有紙片的滅菌培養(yǎng)皿中(每個紙片的飽和吸水量按0.01 mL計)，并翻動紙片使各紙片充分浸透藥液，浸泡5～10 min后用無菌鑷子將紙片上的藥液在平皿上瀝干，平攤于無菌平皿內(nèi)，置37 ℃恒溫箱內(nèi)烘干約2 h，分別裝入青霉素小瓶內(nèi)，同時在瓶上貼藥名標(biāo)簽，置于4 ℃冰箱內(nèi)備用[11]。

1.2.3 紙片法藥敏試驗

用無菌棉拭子蘸取菌液，均勻涂布于營養(yǎng)瓊脂平板表面，將含藥紙片均勻貼于瓊脂表面，每個培養(yǎng)皿貼6片，之后28 ℃培養(yǎng)24 h，用直尺測量抑菌圈直徑,每孔取不同方向測量4次，取其平均值，每種藥物3個平行。抑菌圈直徑≥20 mm為極敏，直徑在15～20 mm之間為高敏；直徑在10～15 mm之間為中敏；直徑小于10 mm為低敏[12-13]。

1.2.4 最小抑菌濃度測定

最小抑菌濃度(Minimum inhibitory concentration，MIC)為抑制細菌生長的藥液最小濃度。采用二倍稀釋法測定這18種中草藥的藥物的最小抑菌濃度(MIC) 。將每種中草藥作為一組，一組13 個無菌試管，貼上標(biāo)簽，在無菌條件下配制13 組中草藥原液濃度梯度。用無菌微量移液器吸取50 μL菌液接種到各濃度梯度的試管中，每種藥物做3個平行。接種后將試管置于28 ℃恒溫振蕩器上振蕩培養(yǎng)24 h 后觀察，用無菌棉簽將每個不同濃度梯度的藥液接種于普通培養(yǎng)基上，每種藥物3個重復(fù)，置于 28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。肉眼觀察，藥物最低濃度無細菌生長者，即為該藥的MIC[12]。同時設(shè)置不添加藥液的空白管作為對照。

1.2.5 最小殺菌濃度的測定

將各種藥物的MIC 和高于MIC 濃度的試管中，吸取0.1 mL 培養(yǎng)物轉(zhuǎn)接于牛肉膏瓊脂斜面培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)2 d 后觀察有無菌落形成，無菌落形成的相應(yīng)試管中的藥物濃度即為該種藥物對該菌株的最小殺菌濃度(MBC)[11]。

2 結(jié)果

2.1 18 種中草藥對哈維氏弧菌的抑菌效果

由所得的結(jié)果(表1)可見，在同種濃度下，蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮五種中草藥對哈維氏弧菌的抑菌作用最明顯，藥效持久，為理想的抑制該菌藥物；黃連、馬齒莧、桉樹葉的抑菌作用明顯；公丁香、魚腥草、穿心蓮的抑菌效果中等，沙棘、黃柏、辣蓼、甘草、薄荷這5 種藥物抑菌直徑小，抑菌效果不明顯；而陳皮、石菖蒲則無抑菌現(xiàn)象出現(xiàn)。

表1 18種中草藥對哈維氏弧菌的抑菌效果Tab.1 Inhibitory effect of 18 kinds of Chinese herbal medicines to V.harveryi

2.2 中草藥對哈維氏弧菌的殺菌濃度

由表2 可見：蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮的MIC 均<12.5 mg/mL ，從而得知蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮的抑菌作用非常明顯。由表2和表3 可見，藥品最小殺菌濃度(MBC) 均> 最小抑菌濃度(MIC) ，在五倍子等18種中草藥中五倍子、石榴皮、蘇木在50 mg/mL 均表現(xiàn)出殺菌作用，大黃、烏梅在100 mg/mL 時表現(xiàn)出殺菌作用，黃連、馬齒莧、桉樹葉、公丁香、魚腥草、穿心蓮在25 mg/mL 時表現(xiàn)出殺菌作用，沙棘、黃柏、辣蓼、甘草、薄荷在500 mg/mL 時才表現(xiàn)出殺菌作用，其余藥物在500 mg/mL 沒有殺菌現(xiàn)象?？梢姡灞蹲?、大黃、 石榴皮、蘇木、烏梅是較好用于防治哈維氏弧菌引起的疾病的中草藥。

表2 18種中草藥對哈維氏弧菌的抑菌濃度Tab.2 The inhibitory concentration of 18 kinds of Chinese herbs on V.harveryi

注：“3”表示高度渾濁，“2”表示中度渾濁，“1”表示有菌生長，“0”無菌生長

表3 18種中草藥對哈維氏弧菌的殺菌濃度Tab.3 Bactericidal concentration of 18 kinds of Chinese herbal medicines of V.harveryi

注：“+ ”表示有菌生長，“-”表示無菌生長

3 討論

3.1 中草藥的抑菌效果

水產(chǎn)動物疾病大多采用抗生素類化學(xué)藥物控制,但存在不易降解、易在養(yǎng)殖動物體內(nèi)富集和污染環(huán)境等問題,長期的使用還可能會導(dǎo)致許多魚類病原細菌產(chǎn)生耐藥性甚至多重耐藥性[12]。中草藥因其綠色環(huán)保、不易產(chǎn)生耐藥性而受到關(guān)注。本試驗挑選18種常用中草藥,以患病大菱鲆分離得到的哈維氏弧菌為試驗菌,進行抑菌藥物的篩選。試驗結(jié)果表明，中草藥水煎液對哈維氏弧菌的體外抑菌效果明顯，其中蘇木、大黃、五倍子、石榴皮、烏梅的抑菌作用最強，抑菌圈直徑均在20 mm以上，MIC為12.5～25 mg/mL，MBC分別為50～100 mg/mL。金珊等[14]研究了15種中草藥對海水網(wǎng)箱養(yǎng)殖的鱸皮膚潰瘍病病原哈氏弧菌的抑菌效果發(fā)現(xiàn)15種中草藥均有一定抑菌作用，其中石榴皮、地榆、五味子抑菌效果最好，最小抑菌濃度分別為1∶640、1∶320、1∶320；梁利國等[15]用4種常用中草藥對病原弧菌(鰻弧菌、副溶血弧菌、霍亂弧菌、河口弧菌)體外抗菌效果作出了研究，其中蘇木、五倍子、地錦草、石榴皮4種中草藥具有較好的抑菌和殺菌作用，MIC和MBC分別為1.56～3.12 mg/mL和3.12～6.25 mg/mL。本試驗抑菌效果較強藥物與其相類似，但抑菌濃度卻是其10倍以上，可能是不同菌種間對藥物的敏感性有差異，這點從梁利國等[15]對四種弧菌的測定結(jié)果也有所證實；也可能由于試驗方法、藥液的熬制方法不同，造成結(jié)果有所差異。關(guān)于中草藥原液的制備、藥敏紙片的制備目前尚缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)方法，試驗方法尚處于摸索階段，所以在不同文獻中病原菌對同一種中草藥的敏感性存在差異。標(biāo)準(zhǔn)的試驗方法還有待于進一步規(guī)范。

3.2 體外抑菌試驗結(jié)果在生產(chǎn)應(yīng)用中的局限性

目前，用中草藥防治水產(chǎn)動物病害是一個研究熱點，但在實驗室得出的體外抑菌試驗結(jié)果應(yīng)用于實際生產(chǎn)時，效果并不一定十分理想。其原因是體外抗菌效果往往與體內(nèi)效果并不完全一致，中草藥的不同來源及其提取方法等都會對藥效產(chǎn)生影響。另外，在實際生產(chǎn)應(yīng)用中，除了考慮藥物的高效外，還應(yīng)考慮魚體對該藥物的耐受能力。正確用藥濃度范圍應(yīng)是既能有效抑制病原菌生長又不至于超過魚體對該藥物的耐受力范圍。從結(jié)果來看，蘇木、大黃、五倍子、烏梅、石榴皮抑菌圈直徑最大(≥20 cm)，抑菌和殺菌效果較強。但本試驗只進行了中草藥的體外抗菌試驗，其結(jié)果可作為防治哈維氏弧菌感染的依據(jù)，在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用效果有待進一步驗證。

當(dāng)今社會正在向著環(huán)保、健康、自然的方向發(fā)展，水產(chǎn)業(yè)也不例外。中草藥被作為“綠色藥品”日益廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)動物養(yǎng)殖[16-18]。我們相信，隨著中醫(yī)理論與現(xiàn)代高科技的有效結(jié)合，中草藥在水產(chǎn)中的應(yīng)用必將再上一個新臺階，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來更大的經(jīng)濟效益。

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