趙長臣，江小燕，劉春花，張德峰，羅 霞，曾偉偉，陳總會，2，黃志斌

(1.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院珠江水產(chǎn)研究所 廣州 510380;2.廣州普麟生物制品有限公司 廣州 510380)

梭鱸(Luciopercalucioperca)原分布于咸海、黑海、波羅的海水系的河流、湖泊中，經(jīng)過多次繁殖已遍及歐洲各國，我國僅自然分布于新疆伊犁河水系和額爾齊斯河水系[1]。上世紀90年代我國梭鱸人工繁育獲得成功，至今東北、華北、華東、華南地區(qū)均有養(yǎng)殖，已成為我國重要的名優(yōu)淡水養(yǎng)殖魚類。梭鱸易發(fā)生車輪蟲、指環(huán)蟲等寄生蟲病害，但在魚苗或養(yǎng)成階段，抗病能力較強，不易患病，目前在我國尚未發(fā)現(xiàn)梭鱸病毒性及細菌性病害發(fā)生的報道。梭鱸為掠食性魚類，飼料以鮮活餌料魚為主，但近年來為了降低養(yǎng)殖成本，廣東順德等地出現(xiàn)了以冰鮮魚代替鮮活餌料魚的現(xiàn)象，加大了梭鱸感染外來病原微生物的潛在威脅。2017年3月廣東省佛山順德一工廠化養(yǎng)殖場出現(xiàn)梭鱸發(fā)病并死亡的現(xiàn)象，一口養(yǎng)殖了4 000 kg梭鱸的內(nèi)循環(huán)水養(yǎng)殖池，水溫20～25 ℃，pH 7.2，魚重200 g左右，魚發(fā)病率高達30%以上，日死亡50～100條，至取樣時死亡持續(xù)期已延續(xù)10日以上。病魚的主要癥狀為雙眼凸出且虹膜充血，體表正常，剖檢可見脾臟腫大，肝臟、腸、腎等器官未見異常，腹內(nèi)無積水，無異味。通過光學(xué)顯微鏡觀察排除真菌及寄生蟲感染。

自1976年P(guān)ier等[2]第一次從魚體上分離到致病鏈球菌，至今致病性無乳鏈球菌在水生動物宿主中被廣泛發(fā)現(xiàn)，主要分布于溫帶和亞熱帶養(yǎng)殖的魚類中，南美洲、亞洲、大洋洲等許多國家均有報道[3-7]，感染魚類包括羅非魚(Oreochromisspp)、虹鱒(Oncorhynchusmykiss)、牙鲆(Paralichthysolivaceus)、真鯛(Pagrosomusmajor)等多種水生動物[8-13]。自2007年以來，中國南方地區(qū)陸續(xù)有羅非魚無乳鏈球菌病暴發(fā)的報道，給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成重大損失。

本研究利用從瀕死梭鱸體內(nèi)分離得到的優(yōu)勢菌株對健康梭鱸進行人工回歸感染，確定其致病性，通過形態(tài)觀察、溶血測定、生理生化特性測定以及結(jié)合生物學(xué)16S rRNA基因序列的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析等方法對病原菌進行分類鑒定，同時進行了耐藥性分析實驗，以期為梭鱸的病原研究及發(fā)病機理、防治措施提供參考。

1 材料與方法

1.1 病原菌的分離與純化

1.1.1 材料來源

梭鱸樣品于2017年3月取自佛山順德某工廠化養(yǎng)殖場，體長35～40 cm，質(zhì)量(250±10)g，患病梭鱸眼睛雙側(cè)明顯凸出，虹膜出血，體表正常，脾臟腫大，其他內(nèi)臟組織未見異常。

1.1.2 細菌分離

分別從患病梭鱸眼、肝臟、脾臟取材接種于血平板，28 ℃培養(yǎng)36～48 h，做細菌分離，所檢的5條病魚不同部位均分離到數(shù)量不同的優(yōu)勢生長單菌落，菌落特征呈半透明、乳白色，光滑圓形，單菌落0.5 mm左右，γ溶血，選取單菌落進一步在血平板上劃線純化，直至獲得純的培養(yǎng)菌株，命名為SL170/株，轉(zhuǎn)接到加腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)瓊脂斜面4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 回歸感染梭鱸、羅非魚實驗

1.2.1 材料來源

健康梭鱸購自廣東佛山順德，規(guī)格為(200±10)g，實驗魚均暫養(yǎng)于珠江水產(chǎn)研究所水生實驗動物房內(nèi)，分離得到的純培養(yǎng)菌株接種于BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃恒溫培養(yǎng)36 h，離心收集菌體，用0.65%的無菌生理鹽水進行稀釋，實驗共分6組菌液梯度，4.5×108、4.5×107、4.5×106、4.5×105、4.5×104、0 CFU/mL。

1.2.2 注射感染

實驗用魚選用暫養(yǎng)一周后的健康梭鱸胸鰭基部腹腔注射，每組梯度菌液注射梭鱸10尾，每尾注射0.2 mL，各組實驗魚均分別隔離養(yǎng)殖于實驗魚池內(nèi)，養(yǎng)殖環(huán)境溫度為25～28 ℃，每隔4 h觀察一次，并記錄感染后的發(fā)病及死亡情況。對發(fā)病的梭鱸進行細菌再分離培養(yǎng)，以能夠引起梭鱸發(fā)病死亡并能重新分離到原感染菌作為分離致病菌的判定標準。

1.3 細菌的形態(tài)觀察及生理生化特性

將分離得到的純培養(yǎng)菌進行涂片革蘭氏染色，并鏡檢，同時純培養(yǎng)菌株分別劃線接種于LB、HBI、5%新生牛血清+HBI、血平板上等培養(yǎng)基，置28 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h，觀察生長情況；參照盧邁新等[14]的鑒定方法采用法國梅里埃自動生化鑒定儀及API 32 STEP快速自動生化鑒定條及其他微生物微量生化鑒定管進行細菌生理生化特性的測定，并根據(jù)測定結(jié)果對致病菌的種屬進行判定。

1.4 細菌的分子鑒定

菌株經(jīng)BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，5 000 r/min離心10 min，收集菌體，按Bacterial DNA Extraction Kit說明書提取細菌基因組DNA，以細菌16S rRNA通用引物進行PCR擴增反應(yīng)，引物序列為：

上游引物F：5′-AGAGTTTGATCCTGGTCAGAACGAACGCT-3′，

下游引物R：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCC-3。

反應(yīng)程序為：94 ℃下預(yù)變性3 min；然后94 ℃下變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，共進行30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)體系為：天根2×Taq PCRMastermix 25 μL，10 μmol/L濃度上游引物F 1 μL，10 μmol/L濃度下游引物R 1 μL，ddH2O 22 μL，DNA模板1 μL，總體系為50 μL，PCR產(chǎn)物進行電泳檢測后送廣州艾基生物技術(shù)有限公司進行測序。將分離菌的所測16S rRNA序列通過NCBI中的Blast工具進行序列比對及同源性分析，并從中選取同源性較高的序列，利用Cluster X5.0分析序列的同源性并利用鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

1.5 分離菌株的血清型及MLST分型測定

病原菌的分子血清型檢測參考Poyart等[15]方法，采用特異性分型引物，以分離菌株的基因組DNA為模板進行擴增，回收PCR產(chǎn)物后進行測序分析，根據(jù)測序結(jié)果通過NCBI中的Blast工具進行序列比對，獲得分離菌株的血清型。

分離菌株的多位點序列分型(MLST)參考Jones等[16]方法，分別對adhP、pheS、atr、glnA、sdn、glcK、tkt七個基因特異性片段進行PCR擴增，片段長度為459～519 bp，擴增引物均引自MLST分型網(wǎng)站http://pubmlst.org/，擴增產(chǎn)物進行回收測序，然后將相應(yīng)序列上傳網(wǎng)站得到唯一等位基因數(shù)值序列，再將該數(shù)值序列上傳致網(wǎng)站，獲得分離菌株的ST序列分型。

1.6 病原菌的耐藥性實驗

采用常規(guī)的瓊脂擴散(紙片)法對經(jīng)過鑒定的菌株進行30種常用抗生素的耐藥性檢測。藥敏片購自杭州天和微生物有限公司，于28 ℃恒溫培養(yǎng)36～48 h后進行觀察，并記錄實驗結(jié)果，根據(jù)抑菌圈的大小對病原菌的耐藥性進行判定。

2 結(jié)果

2.1 病原菌形態(tài)觀察及培養(yǎng)特性

血平板上，病原菌菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，中央隆起狀，半透明，微呈乳白色，γ溶血，培養(yǎng)36～48 h菌落直徑多在1 mm以內(nèi)。 BHI培養(yǎng)基上，病原菌菌落為圓形，乳白色，表面光滑，邊緣整齊，半透明，培養(yǎng)36～48 h菌落直徑1 mm左右。革蘭氏染色顯示，被檢細菌為革蘭氏陽性，球狀，多以鏈狀形式存在。在營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中28 ℃培養(yǎng)36～48 h不生長，在BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)36～48 h可見渾濁。

2.2 對健康梭鱸的致病性及病原重分離

健康梭鱸人工感染分離菌株后，梭鱸感染不同濃度梯度的菌液發(fā)病及死亡程度不同， 4.5×108、4.5×107、4.5×106CFU/mL均出現(xiàn)急性死亡，2 d后就出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，4 d內(nèi)接近100%死亡；4.5×105、4.5×104CFU/mL濃度死亡率明顯降低，全部實驗魚7 d后基本可穩(wěn)定，未再發(fā)生死亡現(xiàn)象；對照組梭鱸在實驗期內(nèi)均健康存活，未見異常。感染死亡狀況見表1。死亡梭鱸均可復(fù)制出自然發(fā)病癥狀，取死亡梭鱸進行病原分離，革蘭氏染色鏡檢，并做生理生化特性鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)分離得到的感染菌在外部形態(tài)、生理生化特性與初始分離得到的感染菌完全一致。

表1 分離菌株梭鱸感染結(jié)果Tab.1 Artificial infection results of the isolated strains

2.3 病原菌生理生化特性

分離菌株ID32 Strep檢驗結(jié)果與常見的β溶血無乳鏈球菌有5項不同或有疑問，根據(jù)生化鑒定結(jié)果及機器判讀，所分離到的菌株初步判定為無乳鏈球菌Steptococcusagalactiae(表2)。核糖發(fā)酵等部分結(jié)果與張德峰等[17]和Evans等[18]已報道的γ溶血無乳鏈球菌生化鑒定結(jié)果也存在差異，因此該菌株的種屬鑒定還需要利用分子生物學(xué)的方法進一步驗證。

表2 ID 32 Strep 生理生化鑒定結(jié)果Tab.2 Physiological and biochemical identification results for isolated strains by ID 32 Strep

注：+：陽性，-：陰性，-/+：結(jié)果不確定。

2.4 16S rRNA基因同源性分析

分離菌株P(guān)CR擴增16S rRNA基因得到一長度為1 500 bp的核酸序列，與預(yù)期目的條帶大小一致，將所得核酸片段進行測序后，將所得序列通過NCBI上BLAST工具進行序列比對，結(jié)果顯示，分離菌株與無乳鏈球菌Streptococcusagalactiae的16S rRNA基因高度同源，同源性達99%～100%，與停乳鏈球菌S.dysgalactiae同源性96%～98%，與海豚鏈球菌S.iniae的同源性為96%～98%，所測序列與GenBank中已知已登錄的其他鏈球菌16S rRNA同源序列進行匹配，構(gòu)建系統(tǒng)進化樹(圖1)，結(jié)果表明分離菌株SL1701序列與無乳鏈球菌聚為一枝，其他海豚鏈球菌S.iniae、停乳鏈球菌S.dysgalactiae等各聚為一枝。

圖1 根據(jù)無乳鏈球菌等的16S rRNA基因構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S r RNA gene of S.agalactia and other bacterial strains

2.5 分離菌株的分子血清型及MLST分型

按照Poyart等[15]方法，分離菌株基因組DNA利用Ib引物擴增出了一條770 bp左右大小條帶，表明SL1701菌株分子血清型為Ib型。

表3 分離菌株藥物敏感性實驗結(jié)果Tab.3 The antibiotic sensitivity test of the isolates

注：S：敏感，I：中度敏感，R：耐藥。

分離菌株SL1701的7個管家基因測序結(jié)果MLST分析表明，adhP、pheS、atr、glnA、sdnA、glcK、tkt 7個等位基因的等位基因類型的賦值分別為54、17、31、4、26、25、19，根據(jù)此數(shù)值序列得到的分離菌株MLST分型為ST261型。

2.6 藥敏實驗

用30種抗生素對致病菌株進行了藥敏實驗，實驗表明：分離菌株對供試的氟苯尼考、氟羅沙星、磺胺異惡唑等17種藥物敏感，對強力霉素、阿奇霉素等5種藥物中度敏感，對氨芐青霉素、四環(huán)素、復(fù)達欣等8種藥物不敏感(表3)。

3 討論

本研究是我國發(fā)現(xiàn)并報道的第一例梭鱸細菌性病害，也是我國第一例無乳鏈球菌感染冷水魚類的報道。在我國南方無乳鏈球菌感染多發(fā)生在羅非魚，大多數(shù)發(fā)病羅非魚類表現(xiàn)癥狀為游動異常，單側(cè)或雙側(cè)眼球突出，角膜發(fā)白渾濁虹膜充血，體表不同程度充血、出血，剖檢后腹內(nèi)多有黃色腹水，膽囊腫大，腦膜充血等癥狀[19]。而本次分離得到的病原菌僅表現(xiàn)出眼球凸出，虹膜充血，脾臟腫大的癥狀，未見其他體表及內(nèi)臟異常，發(fā)病梭鱸只是游動緩慢，未發(fā)現(xiàn)狂游、打轉(zhuǎn)等異?，F(xiàn)象。之所以與羅非魚癥狀不同可能是以下兩個方面的原因：一是發(fā)病魚池最高水溫在25 ℃左右，羅非魚一般在30 ℃以上才會出現(xiàn)大面積發(fā)病感染，25 ℃以下羅非魚養(yǎng)殖鮮有無乳鏈球菌感染發(fā)病的報道，溫度是無乳鏈球菌致病能力的一個重要因素，劉志剛等[7]研究表明，溫度在25～37 ℃時，無乳鏈球菌的生長速度、粘附能力、入侵和轉(zhuǎn)運能力、致病能力均與溫度呈正相關(guān)，37 ℃為無乳鏈球菌最適生長溫度，因此在相對低溫環(huán)境下發(fā)病機制可能也有所不同。二是不同血清型無乳鏈球菌致病機制可能也不完全相同，我國南方羅非魚無乳鏈球菌感染主要集中于Ia血清型，僅有少數(shù)Ib型感染報道。

本研究所分離病原菌溶血活性測定結(jié)果為γ溶血，而國內(nèi)所分離無乳鏈球菌絕大多數(shù)為β溶血[20-22]，目前國內(nèi)僅有3次報道γ溶血型無乳鏈球菌[15，23-24]，本研究所分離的菌株SL1701血清型為Ib-ST271，與張德峰等[17]分離得到的無乳鏈球菌WT1451血清型相同，但WT1451株為強致病性毒株，致病菌的濃度為4.5×103CFU/mL 時，死亡率為85%，而SL1701菌株的濃度為4.5×104CFU/mL 時，死亡率僅為20%，毒力明顯低于張德峰等研究結(jié)果，這可能由于回歸感染實驗溫度不同所致。本研究生理生化鑒定實驗結(jié)果與β溶血無乳鏈球菌具有一定差異，主要表現(xiàn)為核糖、海藻糖、VP實驗等生化項目呈陰性，而β溶血無乳鏈球菌這些項目均呈陽性，但與張德峰、黎婭等[17，23]研究結(jié)果相比除VP項目外，其他生化項目均相符，本研究病原VP反應(yīng)陰性，張德峰等結(jié)果為陽性，黎婭等結(jié)果為陰性，這也再次證明了γ溶血與β溶血的無乳鏈球菌具有不同的生化反應(yīng)譜。Rosinski-Chupin等[25]研究表明γ溶血型無乳鏈球菌的碳源運輸系統(tǒng)和降解多糖相關(guān)酶等基因出現(xiàn)缺失或失活，導(dǎo)致其喪失不同碳源的利用能力，這一定程度上也解釋了為何γ溶血無乳鏈球菌生理生化實驗中過多碳源反應(yīng)為陰性的原因。

目前，當細菌性疾病暴發(fā)時，化藥經(jīng)常是重要治療手段，但由于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)大量化藥的使用，造成了病原菌出現(xiàn)不同程度的耐藥性，本研究所分離無乳鏈球菌因為γ溶血，國內(nèi)鮮有報道該類型菌株的耐藥實驗，本研究分離菌株與國內(nèi)分離的β溶血鏈球菌相比，耐藥性具有一定的差異，如2008年張新燕等[13]從廣東分離的無乳鏈球菌及2012年周清等[26]從海南分離的無乳鏈球菌均對青霉素敏感，而本研究所分離病原對青霉素極度耐受，不形成任何抑菌圈；霍歡歡等[27]對2010—2011年從海南省各地分離的24株菌株進行耐藥性研究，結(jié)果表明所分離無乳鏈球菌對氨基糖苷類(慶大霉素、鏈霉素、新霉素等)敏感性不高，但本研究病原菌對這些藥物較為敏感。之所以出現(xiàn)上述現(xiàn)象可能跟菌種差異和菌株地域來源不同有關(guān)。在實際用藥時應(yīng)結(jié)合耐藥實驗，針對性的施用有效藥物，用于治療及預(yù)防該細菌性疾病的發(fā)生，同時應(yīng)避免濫用、過量施用魚藥，導(dǎo)致加速微生物耐藥變異、藥物殘留等副作用的發(fā)生。

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