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        池塘養(yǎng)殖患病泥鰍兩種病毒病原的電鏡觀察初報(bào)

        2018-05-17 02:35:05劉文枝范玉頂趙建青曾令兵
        淡水漁業(yè) 2018年3期
        關(guān)鍵詞:桿狀病毒電鏡細(xì)胞培養(yǎng)

        劉文枝,范玉頂,江 南,趙建青,周 勇,曾令兵

        (中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所,武漢 430223)

        泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)因其食性雜、適應(yīng)能力與抗病力強(qiáng)、生長(zhǎng)速度快以及藥用、營(yíng)養(yǎng)及經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等優(yōu)點(diǎn),深受廣大養(yǎng)殖者和消費(fèi)者喜愛,已成為廣泛養(yǎng)殖的一種淡水魚特色養(yǎng)殖品種[1-2]。近年來,隨著市場(chǎng)的需求量不斷增加,泥鰍的人工養(yǎng)殖范圍和規(guī)模也在不斷擴(kuò)大,養(yǎng)殖集約化程度不斷提高。在泥鰍高密度、集約化養(yǎng)殖過程中,疾病成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的突出問題之一。然而,目前有關(guān)其病害研究的報(bào)道相對(duì)較少,僅有的少量文獻(xiàn)主要集中于細(xì)菌、真菌和寄生蟲病[3-5]。

        2016年10月份,湖北省荊州市某泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生泥鰍暴發(fā)性死亡,發(fā)病水溫24~26 ℃,發(fā)病率約60%,死亡率高達(dá)80%,抗生素藥物治療無效。本試驗(yàn)對(duì)患病泥鰍組織樣本進(jìn)行了電鏡觀察和細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒初步研究,旨在為深入研究泥鰍疾病的病原學(xué)和有效地進(jìn)行疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。

        1 材料和方法

        1.1 材料

        患病泥鰍采集自湖北省荊州市某泥鰍養(yǎng)殖場(chǎng),患病泥鰍體長(zhǎng)為10~15 cm,體重為15~25 g。選取瀕死的患病泥鰍置于解剖盤中,解剖并迅速剪取肝、脾、腎、腸、心、腦等組織器官,將各組織塊放入適量的2.5%戊二醛溶液中固定,用于電鏡觀察。此外,采集患病泥鰍的脾臟和腎臟組織。病料剪碎,按照1∶10加入PBS,勻漿,凍融3次,4 ℃ 5 000 r/min 離心30 min,收取上清,過濾除菌,作為病毒分離培養(yǎng)用樣品。

        1.2 電子顯微鏡切片的制備與觀察

        將電鏡固定液中的組織塊在4 ℃條件下固定12 h,用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次,每次10 min,隨后用體積分?jǐn)?shù)為1%的鋨酸固定1.5 h。組織塊用磷酸緩沖液沖洗2次后置于梯度乙醇中脫水,再用Epon812包埋劑包埋。使用Leica UC7型超薄切片機(jī)進(jìn)行超薄切片(Germany),將切片置于銅網(wǎng)上用體積分?jǐn)?shù)為2%的醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛聯(lián)合染色后,用透射電子顯微鏡觀察(Hitachi-7650,Japan)。

        1.3 細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒

        利用鯉魚上皮瘤細(xì)胞(EPC)、草魚腎臟細(xì)胞(CIK)、斑點(diǎn)叉尾腎臟細(xì)胞(CCK)、鯽魚腦組織細(xì)胞(GiCB)和草魚性腺細(xì)胞(GCO)等細(xì)胞系,接種患病泥鰍組織勻漿超微過濾液(0.22 μm),經(jīng)傳代培養(yǎng),觀察細(xì)胞病變情況。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 臨床癥狀

        患病泥鰍腹部朝上漂浮于水面(圖1A),腹部、體側(cè)及下頜基部有出血點(diǎn)(圖1B);解剖發(fā)現(xiàn)病魚脾臟充血腫大,膽囊腫大,腎臟彌散性壞死。

        圖1 患病泥鰍臨床癥狀Fig.1 Clinical signs of diseased loach

        2.2 電鏡觀察

        對(duì)患病泥鰍的肝、脾、腎、腸、心、腦等組織進(jìn)行超薄切片并在透射顯微鏡下觀察,在脾、腎、心等組織內(nèi)觀察到有兩種形狀的病毒顆粒存在,患病組織中細(xì)胞嚴(yán)重壞死,細(xì)胞核固縮或染色質(zhì)邊緣化。桿狀的病毒顆粒外包被有囊膜,病毒的形態(tài)多樣,但主要呈桿狀,直徑約50~100 nm,長(zhǎng)度約300~500 nm(圖2)。球形病毒顆粒無囊膜,直徑約50~75 nm(圖3);兩種病毒粒子分布在宿主細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。

        圖2 患病泥鰍脾臟和脾臟組織桿狀病毒電鏡觀察Fig.2 Rod-like viral particles were revealed by transmission electron microscopy in the spleen and kidney of diseased loach(A:患病泥鰍脾臟中桿狀病毒,標(biāo)尺:200 nm 1.0 μm;B:患病泥鰍腎臟中桿狀病毒,標(biāo)尺:2.0 μm;Nu:細(xì)胞核;箭頭:病毒顆粒)

        2.3 細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒

        患病泥鰍內(nèi)臟組織勻漿超微過濾液分別接種EPC、CIK、CCK、GiCB和GCO細(xì)胞,觀察細(xì)胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect,CPE)。其中EPC、CIK、CCK和GCO細(xì)胞的病毒原代培養(yǎng)或盲傳培養(yǎng)均未觀察到細(xì)胞病變效應(yīng),超薄切片電鏡觀察也未見到病毒粒子存在。而使用患病泥鰍組織勻漿超微過濾液接種GiCB細(xì)胞,可觀察到細(xì)胞收縮成團(tuán)、折光度增加,出現(xiàn)典型細(xì)胞病變效應(yīng);將病變的細(xì)胞培養(yǎng)物盲傳3代仍可出現(xiàn)穩(wěn)定的細(xì)胞病變現(xiàn)象,接種細(xì)胞48 h后細(xì)胞單層出現(xiàn)脫落,呈現(xiàn)出典型CPE現(xiàn)象(圖4)。超薄切片電鏡觀察可見球狀的病毒粒子存在于細(xì)胞質(zhì)中,病毒顆粒直徑約為50~75 nm(圖5)。細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒超薄切片電鏡觀察尚未觀察到桿狀病毒顆粒。

        圖3 患病泥鰍脾臟和腎臟組織球狀病毒電鏡觀察Fig.3 Spherical viral particles were revealed by transmission electron microscopy in the spleen and kidney of diseased loach(A:患病泥鰍脾臟中球狀病毒,標(biāo)尺:500 nm;B:患病泥鰍腎臟中球狀病毒,標(biāo)尺:500 nm;Nu:細(xì)胞核;箭頭:病毒顆粒)

        圖4 病毒培養(yǎng)物感染GiCB細(xì)胞后的細(xì)胞病變效應(yīng)Fig.4 Cytopathic effects(CPE) of GiCB cells inoculated with the filtrates of the diseased loach tissues.A:正常的GiCB細(xì)胞;B:病毒培養(yǎng)物感染GiCB細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞病變效應(yīng)。

        圖5 GiCB細(xì)胞中球狀病毒顆粒的電鏡觀察Fig.5 Spherical viral particles were revealed by transmission electron microscopy in the GiCB cellsA、B:GiCB細(xì)胞中球狀病毒顆粒的電鏡觀察(標(biāo)尺:200 nm)。

        3 討論

        目前國(guó)內(nèi)外對(duì)泥鰍疾病的研究主要集中在細(xì)菌、真菌和寄生蟲等病原方面[6-8]。Zhu等[3]從體表患有潰瘍的泥鰍體內(nèi)分離到溫和氣單胞菌;Qin等[4]從患病泥鰍體內(nèi)分離到希瓦氏菌(Shewanellasp.)和利斯頓菌(Listonellasp.),患病泥鰍的臨床癥狀主要表現(xiàn)為病魚嗜睡,食欲不振,體色變黑,全身水腫和腹部的皮膚充血;晏有水等[5]報(bào)道稱,在人工養(yǎng)殖泥鰍過程中還會(huì)出現(xiàn)水霉病、爛鰓病、赤皮病、赤鰭病和腸炎病以及主要寄生蟲病為小瓜蟲病和車輪蟲病。日本學(xué)者Chowdhury等[9]報(bào)道了從體表患有潰瘍泥鰍的體內(nèi)分離到柱狀黃桿菌,潰瘍部位由最初的白色逐漸向黃色過渡。從臨床癥狀上看,患病泥鰍大多數(shù)表現(xiàn)出活力下降、攝食減弱、爛鰓、潰瘍、水腫、充血和發(fā)炎等癥狀。本研究中患病泥鰍體表有明顯出血點(diǎn),尤其是腹部朝上漂浮于水面癥狀突出,但體表潰瘍癥狀不明顯,腹腔內(nèi)無腹水,脾、腎、膽囊等器官出現(xiàn)嚴(yán)重病變。本研究中筆者也開展了細(xì)菌分離鑒定研究,但未分離到以上所報(bào)道的細(xì)菌病原,也未觀察到真菌或寄生蟲病原。

        泥鰍病毒性疾病的報(bào)道很少。1993年,臺(tái)灣學(xué)者Chou等[10]在患病的泥鰍體內(nèi)分離到雙RNA病毒,經(jīng)鑒定該病原與水生動(dòng)物的傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)相近。2016年,Pospichal等[11]的研究結(jié)果顯示,錦鯉皰疹病毒(KHV)不僅能夠感染鯉科魚類,而且能夠感染石鰍。石鰍可作為攜帶體可以攜帶該病毒,但是缺乏病毒超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果。國(guó)內(nèi)有關(guān)泥鰍病毒病的研究尚屬空白。本研究在患病泥鰍的脾臟、腎臟、心臟及腸組織中首次觀察到了球形和桿狀兩種形態(tài)的病毒顆粒,根據(jù)病毒形態(tài)、大小及存在形式等特征,推測(cè)球形病毒顆粒與魚類呼腸孤病毒相似,桿狀的病毒顆粒與感染節(jié)肢動(dòng)物桿狀病毒類型中核型多角體病毒相似,但這兩種病毒的分類地位亟待深入研究。本研究通過細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)試圖分離培養(yǎng)從患病泥鰍體內(nèi)觀察到的兩種形態(tài)病毒病原,結(jié)果發(fā)現(xiàn),球形病毒可引起鯽腦組織細(xì)胞(GiCB)病變,且可連續(xù)傳代培養(yǎng),但未分離到桿狀病毒,暗示實(shí)驗(yàn)中所使用的細(xì)胞系對(duì)于桿狀病毒不敏感,迫切需要建立與篩選該形態(tài)病毒的敏感細(xì)胞系。由于患病泥鰍存在兩種形態(tài)病毒顆粒共感染的現(xiàn)象,因此只有將混合感染的兩種病原分離培養(yǎng)與純化后,才能研究其致病力,從而鑒別主要致病病原。此外,根據(jù)本研究的初步結(jié)果,建議泥鰍養(yǎng)殖生產(chǎn)中對(duì)于病毒性疾病應(yīng)以預(yù)防為主,控制養(yǎng)殖密度和池塘底泥環(huán)境,并及時(shí)采取有效的消毒措施殺滅病原體,投喂可能夠增強(qiáng)機(jī)體免疫力的免疫促進(jìn)劑和天然抗病毒植物藥物,以降低養(yǎng)殖泥鰍病毒性疾病的發(fā)生率。

        參考文獻(xiàn):

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