劉文枝，范玉頂，江 南，趙建青，周 勇，曾令兵

(中國水產(chǎn)科學(xué)研究院長江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)因其食性雜、適應(yīng)能力與抗病力強、生長速度快以及藥用、營養(yǎng)及經(jīng)濟價值高等優(yōu)點，深受廣大養(yǎng)殖者和消費者喜愛，已成為廣泛養(yǎng)殖的一種淡水魚特色養(yǎng)殖品種[1-2]。近年來，隨著市場的需求量不斷增加，泥鰍的人工養(yǎng)殖范圍和規(guī)模也在不斷擴大，養(yǎng)殖集約化程度不斷提高。在泥鰍高密度、集約化養(yǎng)殖過程中，疾病成為制約其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的突出問題之一。然而，目前有關(guān)其病害研究的報道相對較少，僅有的少量文獻主要集中于細菌、真菌和寄生蟲病[3-5]。

2016年10月份，湖北省荊州市某泥鰍養(yǎng)殖場發(fā)生泥鰍暴發(fā)性死亡，發(fā)病水溫24～26 ℃，發(fā)病率約60%，死亡率高達80%，抗生素藥物治療無效。本試驗對患病泥鰍組織樣本進行了電鏡觀察和細胞培養(yǎng)分離病毒初步研究，旨在為深入研究泥鰍疾病的病原學(xué)和有效地進行疾病防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

患病泥鰍采集自湖北省荊州市某泥鰍養(yǎng)殖場，患病泥鰍體長為10～15 cm，體重為15～25 g。選取瀕死的患病泥鰍置于解剖盤中，解剖并迅速剪取肝、脾、腎、腸、心、腦等組織器官，將各組織塊放入適量的2.5%戊二醛溶液中固定，用于電鏡觀察。此外，采集患病泥鰍的脾臟和腎臟組織。病料剪碎，按照1∶10加入PBS，勻漿，凍融3次，4 ℃ 5 000 r/min 離心30 min，收取上清，過濾除菌，作為病毒分離培養(yǎng)用樣品。

1.2 電子顯微鏡切片的制備與觀察

將電鏡固定液中的組織塊在4 ℃條件下固定12 h，用0.1 mol/L磷酸緩沖液沖洗3次，每次10 min，隨后用體積分數(shù)為1%的鋨酸固定1.5 h。組織塊用磷酸緩沖液沖洗2次后置于梯度乙醇中脫水，再用Epon812包埋劑包埋。使用Leica UC7型超薄切片機進行超薄切片(Germany)，將切片置于銅網(wǎng)上用體積分數(shù)為2%的醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛聯(lián)合染色后，用透射電子顯微鏡觀察(Hitachi-7650，Japan)。

1.3 細胞培養(yǎng)分離病毒

利用鯉魚上皮瘤細胞(EPC)、草魚腎臟細胞(CIK)、斑點叉尾腎臟細胞(CCK)、鯽魚腦組織細胞(GiCB)和草魚性腺細胞(GCO)等細胞系，接種患病泥鰍組織勻漿超微過濾液(0.22 μm)，經(jīng)傳代培養(yǎng)，觀察細胞病變情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀

患病泥鰍腹部朝上漂浮于水面(圖1A)，腹部、體側(cè)及下頜基部有出血點(圖1B)；解剖發(fā)現(xiàn)病魚脾臟充血腫大，膽囊腫大，腎臟彌散性壞死。

圖1 患病泥鰍臨床癥狀Fig.1 Clinical signs of diseased loach

2.2 電鏡觀察

對患病泥鰍的肝、脾、腎、腸、心、腦等組織進行超薄切片并在透射顯微鏡下觀察，在脾、腎、心等組織內(nèi)觀察到有兩種形狀的病毒顆粒存在，患病組織中細胞嚴重壞死，細胞核固縮或染色質(zhì)邊緣化。桿狀的病毒顆粒外包被有囊膜，病毒的形態(tài)多樣，但主要呈桿狀，直徑約50～100 nm，長度約300～500 nm(圖2)。球形病毒顆粒無囊膜，直徑約50～75 nm(圖3)；兩種病毒粒子分布在宿主細胞的細胞質(zhì)中。

圖2 患病泥鰍脾臟和脾臟組織桿狀病毒電鏡觀察Fig.2 Rod-like viral particles were revealed by transmission electron microscopy in the spleen and kidney of diseased loach(A：患病泥鰍脾臟中桿狀病毒，標(biāo)尺：200 nm 1.0 μm；B：患病泥鰍腎臟中桿狀病毒，標(biāo)尺：2.0 μm；Nu：細胞核；箭頭：病毒顆粒)

2.3 細胞培養(yǎng)分離病毒

患病泥鰍內(nèi)臟組織勻漿超微過濾液分別接種EPC、CIK、CCK、GiCB和GCO細胞，觀察細胞病變效應(yīng)(Cytopathic effect，CPE)。其中EPC、CIK、CCK和GCO細胞的病毒原代培養(yǎng)或盲傳培養(yǎng)均未觀察到細胞病變效應(yīng)，超薄切片電鏡觀察也未見到病毒粒子存在。而使用患病泥鰍組織勻漿超微過濾液接種GiCB細胞，可觀察到細胞收縮成團、折光度增加，出現(xiàn)典型細胞病變效應(yīng)；將病變的細胞培養(yǎng)物盲傳3代仍可出現(xiàn)穩(wěn)定的細胞病變現(xiàn)象，接種細胞48 h后細胞單層出現(xiàn)脫落，呈現(xiàn)出典型CPE現(xiàn)象(圖4)。超薄切片電鏡觀察可見球狀的病毒粒子存在于細胞質(zhì)中，病毒顆粒直徑約為50～75 nm(圖5)。細胞培養(yǎng)分離病毒超薄切片電鏡觀察尚未觀察到桿狀病毒顆粒。

圖3 患病泥鰍脾臟和腎臟組織球狀病毒電鏡觀察Fig.3 Spherical viral particles were revealed by transmission electron microscopy in the spleen and kidney of diseased loach(A：患病泥鰍脾臟中球狀病毒，標(biāo)尺：500 nm；B：患病泥鰍腎臟中球狀病毒，標(biāo)尺：500 nm；Nu：細胞核；箭頭：病毒顆粒)

圖4 病毒培養(yǎng)物感染GiCB細胞后的細胞病變效應(yīng)Fig.4 Cytopathic effects(CPE) of GiCB cells inoculated with the filtrates of the diseased loach tissues.A：正常的GiCB細胞；B：病毒培養(yǎng)物感染GiCB細胞產(chǎn)生的細胞病變效應(yīng)。

圖5 GiCB細胞中球狀病毒顆粒的電鏡觀察Fig.5 Spherical viral particles were revealed by transmission electron microscopy in the GiCB cellsA、B：GiCB細胞中球狀病毒顆粒的電鏡觀察(標(biāo)尺：200 nm)。

3 討論

目前國內(nèi)外對泥鰍疾病的研究主要集中在細菌、真菌和寄生蟲等病原方面[6-8]。Zhu等[3]從體表患有潰瘍的泥鰍體內(nèi)分離到溫和氣單胞菌；Qin等[4]從患病泥鰍體內(nèi)分離到希瓦氏菌(Shewanellasp.)和利斯頓菌(Listonellasp.)，患病泥鰍的臨床癥狀主要表現(xiàn)為病魚嗜睡，食欲不振，體色變黑，全身水腫和腹部的皮膚充血；晏有水等[5]報道稱，在人工養(yǎng)殖泥鰍過程中還會出現(xiàn)水霉病、爛鰓病、赤皮病、赤鰭病和腸炎病以及主要寄生蟲病為小瓜蟲病和車輪蟲病。日本學(xué)者Chowdhury等[9]報道了從體表患有潰瘍泥鰍的體內(nèi)分離到柱狀黃桿菌，潰瘍部位由最初的白色逐漸向黃色過渡。從臨床癥狀上看，患病泥鰍大多數(shù)表現(xiàn)出活力下降、攝食減弱、爛鰓、潰瘍、水腫、充血和發(fā)炎等癥狀。本研究中患病泥鰍體表有明顯出血點，尤其是腹部朝上漂浮于水面癥狀突出，但體表潰瘍癥狀不明顯，腹腔內(nèi)無腹水，脾、腎、膽囊等器官出現(xiàn)嚴重病變。本研究中筆者也開展了細菌分離鑒定研究，但未分離到以上所報道的細菌病原，也未觀察到真菌或寄生蟲病原。

泥鰍病毒性疾病的報道很少。1993年，臺灣學(xué)者Chou等[10]在患病的泥鰍體內(nèi)分離到雙RNA病毒，經(jīng)鑒定該病原與水生動物的傳染性胰腺壞死病毒(IPNV)相近。2016年，Pospichal等[11]的研究結(jié)果顯示，錦鯉皰疹病毒(KHV)不僅能夠感染鯉科魚類，而且能夠感染石鰍。石鰍可作為攜帶體可以攜帶該病毒，但是缺乏病毒超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果。國內(nèi)有關(guān)泥鰍病毒病的研究尚屬空白。本研究在患病泥鰍的脾臟、腎臟、心臟及腸組織中首次觀察到了球形和桿狀兩種形態(tài)的病毒顆粒，根據(jù)病毒形態(tài)、大小及存在形式等特征，推測球形病毒顆粒與魚類呼腸孤病毒相似，桿狀的病毒顆粒與感染節(jié)肢動物桿狀病毒類型中核型多角體病毒相似，但這兩種病毒的分類地位亟待深入研究。本研究通過細胞培養(yǎng)技術(shù)試圖分離培養(yǎng)從患病泥鰍體內(nèi)觀察到的兩種形態(tài)病毒病原，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，球形病毒可引起鯽腦組織細胞(GiCB)病變，且可連續(xù)傳代培養(yǎng)，但未分離到桿狀病毒，暗示實驗中所使用的細胞系對于桿狀病毒不敏感，迫切需要建立與篩選該形態(tài)病毒的敏感細胞系。由于患病泥鰍存在兩種形態(tài)病毒顆粒共感染的現(xiàn)象，因此只有將混合感染的兩種病原分離培養(yǎng)與純化后，才能研究其致病力，從而鑒別主要致病病原。此外，根據(jù)本研究的初步結(jié)果，建議泥鰍養(yǎng)殖生產(chǎn)中對于病毒性疾病應(yīng)以預(yù)防為主，控制養(yǎng)殖密度和池塘底泥環(huán)境，并及時采取有效的消毒措施殺滅病原體，投喂可能夠增強機體免疫力的免疫促進劑和天然抗病毒植物藥物，以降低養(yǎng)殖泥鰍病毒性疾病的發(fā)生率。

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