李夢(mèng)榮，田 雪，龐小磊，王良炎，胡 菊，董傳舉，李學(xué)軍，王團(tuán)記

(河南師范大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，河南新鄉(xiāng) 453007)

錦鯉(CyprinuscarpioKoi)屬于鯉形目(Cypriniformes)鯉科(Cyprinidae)鯉屬(Cyprinus)。鯉科為魚類中最大的一個(gè)科，分布廣泛[1]。錦鯉體表被鱗色彩艷麗、花紋多變，具極高的觀賞和飼養(yǎng)價(jià)值，是風(fēng)靡當(dāng)今世界的一種體型較大的觀賞魚類，素有“會(huì)游泳的藝術(shù)品”、“水中活寶石”等美稱[2，3]。經(jīng)過(guò)200多年的培育，錦鯉中出現(xiàn)了眾多品系，可分為13類126種[4]，錦鯉品系一般由雜交和長(zhǎng)期的人工選擇獲得，在觀賞和養(yǎng)殖過(guò)程中主要是以色斑來(lái)進(jìn)行挑選與分類，因此，即使表形特征一樣的個(gè)體，其基因型卻可能存在極大的差異，這也導(dǎo)致其遺傳背景十分復(fù)雜，體色變化有很強(qiáng)的不確定性，所以在養(yǎng)殖過(guò)程中找到體色穩(wěn)定遺傳的錦鯉必須萬(wàn)中挑一[5]。

現(xiàn)今，關(guān)于鯉科魚類種屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的報(bào)道較多，但錦鯉養(yǎng)殖品系間的親緣關(guān)系研究很少，多利用形態(tài)學(xué)[6，7]或微衛(wèi)星標(biāo)記[8，9]方法對(duì)紅白錦鯉、昭和錦鯉、大正錦鯉和烏鯉進(jìn)行遺傳分析，其它主要養(yǎng)殖品系間的遺傳差異尚不清晰。魚類線粒體基因是結(jié)構(gòu)高度緊湊的共價(jià)雙鏈閉環(huán)分子[10]，長(zhǎng)度約為15～20 kb[11]，具有分子小、進(jìn)化速度快、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單和母性遺傳[12]等特點(diǎn)，在分子遺傳學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多。本研究以河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地培育的6個(gè)錦鯉養(yǎng)殖品系為研究對(duì)象，利用線粒體COI和Cytb基因分析錦鯉養(yǎng)殖品系間的遺傳差異，探討各品系間的進(jìn)化和親緣關(guān)系，為錦鯉的系統(tǒng)進(jìn)化提供分子生物學(xué)依據(jù)，也為優(yōu)質(zhì)錦鯉選育提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 研究樣品來(lái)源及總DNA提取

6個(gè)錦鯉品系為河南師范大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖基地培育，表1為品系的名稱和數(shù)量等信息。酚-氯仿抽提法從錦鯉鰭條組織中提取總DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量。

表1 錦鯉品系的名稱和數(shù)量Tab.1 C.carpio Koi sample names and quantity

1.2 COI和Cytb基因擴(kuò)增及序列測(cè)定

根據(jù)NCBI中錦鯉COI基因和Cytb基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，具體引物序列如下：正向引物COIF(AGTATAAGCGTCTGGGTAGTC)、CytbF(AACCACCGTTGTATTCAACTACAA)和反向引物COIR(CCTGCAGGAGGAGGAGAYCC)、CytbR(ACCTCCGATCTTCGGATTACAAGACCG)，由武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成。PCR反應(yīng)體系：2×PCR Taq MasterMix12.5 μL、上下游引物(10 μmol/L)各0.75 μL、DNA模板1 μL，補(bǔ)足dd H2O到25 μL。PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性94 ℃ 3 min，變性94 ℃ 30 s，退火60 ℃ 1 min，延伸72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)，終延伸72 ℃ 5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，送武漢天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司、金斯瑞公司和生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3 序列分析

測(cè)序結(jié)果用Clustalx 2.1軟件進(jìn)行比對(duì)，MEGA7.0[13]計(jì)算線粒體COI和Cytb基因序列的堿基組成，確定變異位點(diǎn)和簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)的個(gè)數(shù)，群體內(nèi)和群體間的遺傳距離。DNAsp v.5[14]統(tǒng)計(jì)單倍型個(gè)數(shù)，計(jì)算單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)和核苷酸多樣性(π)等。Arlequin3.1[15]計(jì)算品系間的遺傳分化系數(shù)等。MEGA7.0軟件中的鄰接法(Neighbor-Joining，NJ)構(gòu)建單倍型和品系全部個(gè)體的系統(tǒng)進(jìn)化樹，系統(tǒng)樹各節(jié)點(diǎn)支持率采用Bootstrap 1 000次重復(fù)檢驗(yàn)置信度[16]。

2 結(jié)果

2.1 序列與單倍型分析

用于進(jìn)行品系間分析的COI基因序列長(zhǎng)602 bp，A、T、G、C的平均堿基含量分別為26.6%、30.4%、18.5%、24.5%。其中包括594個(gè)保守位點(diǎn)，8個(gè)變異位點(diǎn)，3個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。COI基因中檢測(cè)到的7種單倍型及單倍型序列變異位點(diǎn)見表2，其中H1、H2、H4為群體間共有單倍型， H3為黑錦鯉(HL)所特有，H5為全白錦鯉(QB)所特有，H6、H7為全紅錦鯉(QH)所特有。

用于進(jìn)行品系間分析的Cytb基因序列長(zhǎng)1 117 bp，A、T、G、C的平均堿基含量分別為29.5%、26.5%、13.8%、30.2%。其中包括1 102個(gè)保守位點(diǎn)，15個(gè)變異位點(diǎn)，12個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。Cytb基因中檢測(cè)到的6種單倍型及單倍型序列變異位點(diǎn)見表3，其中HH1、HH2、HH4為群體間共有單倍型，HH3為HL所特有，HH5為QB所特有，HH6為QH所特有。

6個(gè)錦鯉品系基于COI和Cytb基因序列的遺傳多樣性結(jié)果如表4所示，COI基因序列Hd在0.436±0.133～0.709±0.083之間，π在0.000 7±0.000 2～0.003 0±0.000 6之間。Cytb基因Hd在0.318±0.164～0.709±0.083之間，π在0.001 6±0.000 5～0.005 0±0.001 0之間。所有品系COI和Cytb的Tajima’s D中性檢驗(yàn)結(jié)果為-1.370 7～1.448 8、-1.704 6～1.905 7，中性檢驗(yàn)結(jié)果均不顯著(P>0.05)，符合中性突變。

表2 COI基因單倍型及在6個(gè)品系的分布Tab.2 Haplotypes of COI gene and its distribution in 6 varieties

表4 6個(gè)品系基于線粒體COI和Cytb基因序列的遺傳多樣性指數(shù)Tab.4 Genetic diversity index base on COI and Cytb sequence in 6 varieties

2.2 品系間的遺傳距離及遺傳分化

利用線粒體COI和Cytb基因序列比較6個(gè)品系的遺傳分化系數(shù)，根據(jù)軟件AMOVA結(jié)果顯示，品系內(nèi)遺傳差異高于品系間的差異(表5)。 表6所示，基于COI基因的6個(gè)養(yǎng)殖品系群體間遺傳分化系數(shù)FST在-0.029 1～0.623 8之間，SS和QB之間的遺傳差異最大，為0.623 8，HL和QH間遺傳差異最小，為0.059 9；HJ和QB之間的遺傳距離最近，為0.001 6，SS和QH之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.003 6。并且QB品系內(nèi)遺傳距離最小，為0.000 7，HL的種內(nèi)遺傳距離最大，為0.003 0，經(jīng)比對(duì)，遺傳距離與FST分析結(jié)果基本一致。

基于Cytb基因的6個(gè)養(yǎng)殖品系FST在-0.041 5～0.690 2之間，SS和QH間遺傳差異最大，為0.690 2，HJ和QH間遺傳差異最小為0.108 0；QH和QB之間的遺傳距離最近，為0.003 0，SS和QH之間的遺傳距離最遠(yuǎn)，為0.007 2。此外，QB品系內(nèi)遺傳距離最小，為0.001 6，HL的種內(nèi)遺傳距離最大，為0.005 0，經(jīng)比對(duì)，遺傳距離與FST分析結(jié)果基本一致(表7)。

表5 6個(gè)品系線粒體COI和Cytb序列的AMOVA結(jié)果Tab.5 The result of AMOVA based on COI and Cytb gene of mtDNA in 6 varieties

表6 基于COI基因的6個(gè)品系間平均遺傳距離、FST值及各個(gè)品系內(nèi)平均遺傳距離Tab.6 average genetic distance between and within 6 varieties and FST

注:對(duì)角線以上為群體間的遺傳距離，對(duì)角線以下為群體間的FST，*表示差異顯著(P<0.05)。表7同。

表7 基于Cytb基因的6個(gè)品系間平均遺傳距離、FST值及各個(gè)品系內(nèi)平均遺傳距離Tab.7 average genetic distance between and within 6 varieties and FST

2.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹

根據(jù)COI基因和Cytb基因單倍型構(gòu)建品系之間的NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹(圖1、2)。從圖1、圖2中得到，6個(gè)品系可分為三支， HL、QH聚為一支；SS、HB、HJ聚為一支，QB單獨(dú)聚為一支。因此，HL和QH親緣關(guān)系較近，SS、HB和HJ親緣關(guān)系較近,QB與其他品系的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)。

圖1 基于鄰接法構(gòu)建的COI基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbor-joining tree of COI gene haplotypes

圖2 基于鄰接法構(gòu)建的Cytb基因單倍型系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Neighbor-joining tree of Cytb gene haplotypes

3 討論

3.1 序列及單倍型

本研究分析并比較了6個(gè)錦鯉養(yǎng)殖品系線粒體COI和Cytb基因部分序列的堿基差異。結(jié)果顯示錦鯉各品系COI和Cytb基因序列中G含量最低(18.5%/13.9%)，且AT含量(57%/56%)明顯高于GC含量(43%/44%)，這與魚類線粒體基因堿基組成中存在的反G偏倚現(xiàn)象相一致，大部分生物基因組中出現(xiàn)的堿基偏向性現(xiàn)象十分廣泛，且不同種屬的堿基不均衡程度也不盡相同[17]。產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因有：基因長(zhǎng)度、基因的表達(dá)水平、堿基組分以及密碼子反密碼子間的結(jié)合能力等[18]。

7個(gè)COI基因單倍型中單倍型H1、H2和H4為群體所共有，且這3種單倍型的個(gè)體數(shù)為51個(gè)，占總數(shù)的82.26%， 6個(gè)Cytb基因單倍型中H1、H2和H4單倍型為群體所共有，且具有這3種單倍型的個(gè)體數(shù)為52個(gè)，占總數(shù)的83.87%，推測(cè)單倍型H1、H2和H4很可能是較原始的單倍型類型?；贑OI和Cytb基因研究的6個(gè)品系中紅白錦鯉均具有最高的Hd值，黑錦鯉具有最高的π值，這可能與錦鯉的選育歷史有一定的關(guān)系，Kock等[19]研究證實(shí)：黑錦鯉和紅白錦鯉處于較原始的位置，通常以黑錦鯉和紅白錦鯉為親本選育其他品系類型。

3.2 群體間的親緣關(guān)系分析

單倍型結(jié)果顯示，COI基因和Cytb基因都能夠區(qū)分其中一些品系(黑錦鯉、全白錦鯉、全紅錦鯉)，但多數(shù)品系不具有獨(dú)特的單倍型(所有的品系共享單倍型H1；黑錦鯉、三色錦鯉、紅白錦鯉共享單倍型H2；三色錦鯉、紅白錦鯉、黃金錦鯉、全紅錦鯉共享單倍型H4)，遺傳距離結(jié)果與單倍型結(jié)果一致，SS、HB、HJ遺傳距離較近，SS和QH之間的遺傳距離最遠(yuǎn)。NJ系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果同樣顯示，黑錦鯉和全紅錦鯉親緣關(guān)系較近，三色錦鯉、紅白錦鯉和黃金錦鯉親緣關(guān)系較近，全白錦鯉單獨(dú)聚為一支。錦鯉雜交遺傳圖譜、Pietsch等[20]和Kock等[19]的研究顯示，黑錦鯉和全紅錦鯉由鐵真鯉(C.carpioTetsu Magoi)選育而來(lái)，因此它們的親緣關(guān)系較近，聚為一支。紅白錦鯉和黃金錦鯉由淺黃真鯉(C.carpioAsagi Magoi)選育產(chǎn)生，三色錦鯉由紅白錦鯉選育而來(lái)，因此它們的親緣關(guān)系較近，聚為一支。全白錦鯉雖然也由淺黃真鯉選育產(chǎn)生，但選育過(guò)程冗長(zhǎng)，經(jīng)歷了多代雜交篩選，與其他品系的親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，但不排除個(gè)別個(gè)體與其他品系的親緣關(guān)系較近。除全白錦鯉外，黑錦鯉、全紅錦鯉和三色錦鯉、紅白錦鯉、黃金錦鯉存在一定的交集，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是與錦鯉選育歷史和市場(chǎng)流行趨勢(shì)相關(guān)，現(xiàn)今品系選育大都以觀賞性狀為目標(biāo)，通過(guò)種間雜交達(dá)到培育優(yōu)質(zhì)錦鯉的目的，也導(dǎo)致錦鯉基因雜合度高，遺傳背景復(fù)雜。

3.3 單倍型分析的可行性

相較于其他分子標(biāo)記，DNA序列分析[21]可更準(zhǔn)確直接地反映物種的遺傳多樣性。魚類線粒體基因中，COI基因和Cytb基因具有進(jìn)化速率適中、易擴(kuò)增、易排序[22]及富含系統(tǒng)發(fā)育信息[23]等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于種群遺傳多樣性研究、魚類種質(zhì)資源狀況調(diào)查、物種鑒定及分子系統(tǒng)發(fā)育探究[7，24-27]。

本實(shí)驗(yàn)利用線粒體COI和Cytb基因?qū)?個(gè)錦鯉養(yǎng)殖品系進(jìn)行遺傳多樣性分析，明確品系間親緣關(guān)系，為培育優(yōu)質(zhì)錦鯉品系提供研究基礎(chǔ)，為錦鯉的遺傳選育和種質(zhì)保護(hù)提供一定的理論數(shù)據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳湘粦,樂(lè)佩琦,林人端.鯉科的科下類群及其宗系發(fā)生關(guān)系[J].動(dòng)物分類學(xué)報(bào),1984(4):91-107.

[2]Kelsh R N.Genetics and evolution of pigment patterns in fish[J].Pigm Cell Res，2004，17(4)：326-336.

[3]Hoekstra H E.Genetics，development and evolution of adaptive pigmentation in vertebrates[J].Heredity，2006，97(3)：222.

[4]蘇建通.錦鯉的養(yǎng)殖與鑒賞[M].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2011.

[5]劉靜霞,周 莉,趙振山,等.錦鯉4個(gè)人工雌核發(fā)育家系的微衛(wèi)星標(biāo)記研究[J].動(dòng)物學(xué)研究,2002,23(2):97-105.

[6]王安利,劉金海,王維娜.錦鯉總色素及色素組分的比較研究[J].水生生物學(xué)報(bào),2005,29(6):694-698.

[7]孫 莉.長(zhǎng)鰭鯉、錦鯉和龍鳳鯉的遺傳多樣性研究[D].江蘇揚(yáng)州：揚(yáng)州大學(xué),2009.

[8]劉靜霞,周 莉,魏麗華,等.紅白錦鯉人工雌核發(fā)育純系的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J].水生生物學(xué)報(bào),2003,27(6):557-562.

[9]陳萬(wàn)光,王 慧.2個(gè)錦鯉人工養(yǎng)殖群體遺傳多樣性的微衛(wèi)星標(biāo)記分析[J].水生態(tài)學(xué)雜志,2009,2(1):47-50.

[10]龔 理,時(shí) 偉,司李真,等.魚類線粒體DNA重排研究進(jìn)展[J].動(dòng)物學(xué)研究,2013,34(6):666-673.

[11]郭新紅,劉少軍,劉 巧,等.魚類線粒體DNA研究新進(jìn)展[J].遺傳學(xué)報(bào),2004,31(9):983-1000.

[12]Birky C W.The Inheritance of genes in mitochondria and chloroplasts[J].BioScience，1976，26(1)：26-33.

[13]Tamura K，Dudley J，Nei M，et al.MEGA4：Molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0[J].Mol Biol Evol，2007，24(24)：1596-1599.

[14]Librado P，Rozas J.DnaSP v5：a software for comprehensive analysis of DNA polymorphism data[J].Bioinformatics，2009，25(11)：1451-1452.

[15]Excoffier L，Laval G，Schneider S.Arlequin (version 3.0)：An integrated software package for population genetics data analysis[J].Evol Bioinf Online，2005，1(4A)：47-50

[16]Saitou N，Nei M.The neighbor-joining method：a new method for reconstructing phylogenetic trees[J].Mol Biol Evol，1987，4(4)：406.

[17]童金茍,吳清江.三個(gè)鯉品種線粒體基因片段序列保守性[J].水生生物學(xué)報(bào),2001,25(1):1-7.

[18]Fedorov A，Saxonov S，Gilbert W.Regularities of context-dependent codon bias in eukaryotic genes[J].Nucleic Acids Res，2002，30(5)：1192.

[19]Kock S D，Gomelsky B.Japanese ornamental koi carp：origin，variation and genetics[M].Florida：CRC Press，Boca Raton，2015：27-53.

[20]Pietsch C，Hirsch P，Pietsch C，et al.Biology and ecology of carp[J].J Fish Biol，2015，88(2)：825-826.

[21]Buonaccorsi V P，Mcdowell J R，Graves J E.Reconciling patterns of inter-ocean molecular variance from four classes of molecular markers in blue marlin (Makaira nigricans)[J].Mol Ecol，2001，10(5)：1179-1196.

[22]俞建中.黃海鰈形目魚類系統(tǒng)發(fā)生與分子進(jìn)化的初步研究[D].山東青島：中國(guó)海洋大學(xué),2004.

[23]張 迪,雷光春,龔 成,等.基于COI基因序列的太湖新銀魚遺傳多樣性[J].湖泊科學(xué),2012,24(2):299-306.

[24]Miya M，Takeshima H，Endo H，et al.Major patterns of higher teleostean phylogenies：a new perspective based on 100 complete mitochondrial DNA sequences[J].Mol Phylogen Evol，2003，26(1)：121-138.

[25]劉連為,許強(qiáng)華,陳新軍.基于線粒體COI和Cytb基因序列的北太平洋柔魚種群遺傳結(jié)構(gòu)研究[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào),2012,36(11):1675-1684.

[26]單云晶,魯翠云,李 超,等.基于線粒體COI基因序列的5種鯉養(yǎng)殖品種遺傳多樣性研究[J].中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)，2013,30(5):931-938.

[27]于 濤,吳 彪,楊愛(ài)國(guó),等.櫛孔扇貝、蝦夷扇貝及其雜交子代線粒體COI和Cytb基因遺傳多樣性分析[J].海洋科學(xué),2016,40(3):1-9.