劉淑芬，王 琦，馬 亞，曾學(xué)軍

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 物理醫(yī)學(xué)康復(fù)科, 北京 100730；2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 風(fēng)濕免疫科, 江蘇 南京 210029； 3.首都兒科研究所附屬兒童醫(yī)院 超聲科, 北京 100020;4.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院 普通內(nèi)科, 北京 100730)

近年來，國(guó)內(nèi)外大樣本臨床流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，高尿酸血癥(hyperuricemia，HU)可以增加人體發(fā)生心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)[1- 2]，這些結(jié)果越來越被臨床關(guān)注， 甚至有專家提出應(yīng)該開始對(duì)合并心腦血管危險(xiǎn)因素的HU患者進(jìn)行治療[3]。迄今，基礎(chǔ)研究對(duì)于HU升高心血管疾病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制研究甚少，HU是否能夠引起或加速動(dòng)脈粥樣硬化尚無(wú)確證研究。本研究建立長(zhǎng)期HU大鼠模型,來觀察單純HU12周能否引起大鼠主動(dòng)脈動(dòng)脈粥樣硬化病理變化，并對(duì)HU的致病機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)SD雄性大鼠16只，體質(zhì)量200～250 g[北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證：SCXK(京)2016- 0006]。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過單位倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，對(duì)動(dòng)物處置方法符合動(dòng)物倫理學(xué)要求。

實(shí)驗(yàn)試劑：氧嗪酸鉀(濟(jì)南中科一通化工有限公司)；尿酸(Sigma Aldrich公司)；氧嗪酸鉀大鼠飼料(每10 kg飼料內(nèi)加入200 g氧嗪酸鉀,北京科奧協(xié)利飼料有限公司)；普通大鼠飼料(北京科奧協(xié)利飼料有限公司)；尿酸飲水(尿酸用滅菌動(dòng)物飲用水配成 100 μmol/L溶液)自配；氧嗪酸鉀灌胃液(氧嗪酸鉀用滅菌動(dòng)物飲用水配成 100 mg/mL混懸液)自配。

1.2 方法

大鼠分組及處理：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，采集基礎(chǔ)數(shù)據(jù)后，將大鼠隨機(jī)分成空白對(duì)照組及HU組，空白對(duì)照組給予普通飼料、水飼養(yǎng)，HU組給予氧嗪酸鉀飼料+尿酸飲水飼養(yǎng)，給藥第7、14、21、28、35、49、63、77和84天下午將大鼠禁食12～14 h，次晨稱質(zhì)量，乙醚麻醉后經(jīng)內(nèi)眥采血,監(jiān)測(cè)血尿酸水平，維持造模組血尿酸持續(xù)顯著高于空白對(duì)照組。

標(biāo)本獲?。簩?shí)驗(yàn)開始后第84天(12周末)， 經(jīng)腹腔注射2%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，經(jīng)腹主動(dòng)脈取血后處死大鼠，向上剪開胸腔，在胸腔內(nèi)找到心臟和胸腹主動(dòng)脈，剔除周圍脂肪組織及疏松結(jié)締組織，將胸腹主動(dòng)脈剪下，0.9%的氯化鈉溶液清洗一下腔內(nèi)血塊，剪去1段腹主動(dòng)脈放入已標(biāo)號(hào)的含甲醛溶液的小瓶?jī)?nèi)固定。

HE染色：大鼠主動(dòng)脈標(biāo)本的經(jīng)固定、包埋和切片，HE染色，光鏡下測(cè)定主動(dòng)脈內(nèi)膜-中膜厚度變化、內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及內(nèi)膜表層脂紋脂斑形成情況。

免疫組化：大鼠主動(dòng)脈標(biāo)本的經(jīng)固定、包埋和切片，免疫組織化學(xué)法測(cè)定eNOS、ET- 1、ICAM的表達(dá)，用著色細(xì)胞平均吸光度值指標(biāo)進(jìn)行分析，所有病理圖像均使用計(jì)算機(jī)顯微圖像分析系統(tǒng)(image-pro plus6.0)。

ELISA和酶法：大鼠內(nèi)眥取血后，立即離心取血清，保存于-25 ℃冰箱中，使用全自動(dòng)生化分析儀Olmpus AU 5400，進(jìn)行血尿酸檢測(cè)，使用ELISA進(jìn)行ET- 1和ICAM的檢查，使用酶法進(jìn)行血清NO的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果2.1 動(dòng)物一般資料

第14天時(shí)，HU組血清尿酸(UA)濃度(239±38)μmol/L較對(duì)照組(189±29)μmol/L顯著升高(P<0.05)；之后，HU組大鼠血清尿酸濃度均較對(duì)照組顯著升高(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control group圖1 兩組大鼠各時(shí)間點(diǎn)血清尿酸濃度Fig 1 Serum UA at different days

2.2 主動(dòng)脈病理改變

2.2.1 主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)變化

2.2.1.1 內(nèi)膜-中膜厚度變化：正常對(duì)照組動(dòng)脈壁內(nèi)膜表面完整光滑無(wú)損傷，中膜平滑肌排列整齊，厚薄均勻。HU組部分大鼠可見動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞水腫和脫落(2/8)，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂(2/8)，部分平滑肌有細(xì)胞水腫和增殖，內(nèi)膜灶性增厚(2/8)。內(nèi)膜-中膜厚度輕度增加(圖2)。

2.2.1.2 內(nèi)膜炎性細(xì)胞浸潤(rùn)：正常對(duì)照組內(nèi)膜表面光滑完整無(wú)損傷，內(nèi)皮細(xì)胞排列緊密無(wú)脫落，少見單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎性細(xì)胞黏附和浸潤(rùn)(圖2A)。HU組部分大鼠可見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，部分脫落；1只大鼠內(nèi)膜出現(xiàn)大量單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和泡沫細(xì)胞聚集(圖2B)。

A.arota in control group(×200)；B.arota in HU group(×200)； C.arota in control group(×400)；D.arota in HU group(×400)

圖2大鼠主動(dòng)脈HE染色
Fig2RatarotaHEstaining

2.2.1.3 內(nèi)膜脂斑形成情況：HU組1只動(dòng)物動(dòng)脈內(nèi)膜出現(xiàn)小脂斑，表現(xiàn)為泡沫細(xì)胞聚集，周邊可找到單核巨噬細(xì)胞，但病灶內(nèi)未找到變性的膠原纖維(圖2B)。

2.2.2 主動(dòng)脈eNOS、ET- 1、ICAM蛋白表達(dá)變化

2.2.2.1 主動(dòng)脈eNOS表達(dá)：高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞漿染成黃褐色提示有eNOS表達(dá)，HU組主動(dòng)脈內(nèi)膜黃染的eNOS表達(dá)較對(duì)照組明顯減少(216±33vs308±42，P<0.05)(圖3)。

A.arota in control group(×400)； B.arota in HU group(×400)圖3 大鼠主動(dòng)脈eNOS染色Fig 3 Rat arota eNOS staining

2.3.2.2 主動(dòng)脈ET- 1表達(dá)：高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿染成黃褐色提示有ET- 1表達(dá)。HU組主動(dòng)脈內(nèi)膜的ET- 1表達(dá)顯著高于對(duì)照組(423±45vs278±31，P<0.05)(圖4)。

2.2.2.3 主動(dòng)脈ICAM表達(dá)：高倍鏡下陽(yáng)性細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞漿染成黃褐色提示有ICAM表達(dá)。與正常對(duì)照組比較，HU組主動(dòng)脈內(nèi)膜的ICAM表達(dá)明顯增強(qiáng)(356±28vs210±23，P<0.05)(圖5)。

A.arota in control group(×400)；B.arota in HU group(×400)圖4 大鼠主動(dòng)脈ET- 1染色Fig 4 Rat arota ET- 1 staining

A.arota in control group(×400)；B.arota in HU group(×400)圖5 大鼠主動(dòng)脈ICAM染色 Fig 5 Rat arota ICAM staining

2.3 血清ET- 1、ICAM、NO濃度

實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)D84，HU組大鼠血清ET- 1和ICAM均較對(duì)照組顯著升高;而 NO較對(duì)照組顯著降低(表1)。

表1 兩組大鼠血清ET- 1、ICAM、NO濃度

*P<0.05,**P<0.01 compared with control.

3 討論

本研究通過長(zhǎng)期氧嗪酸鉀飼料以及尿酸水喂養(yǎng)與氧嗪酸灌胃合并的方法，建立了長(zhǎng)期高尿酸血癥(hyperuricemia，HU)大鼠模型，發(fā)現(xiàn)造模12周后HU組大鼠可見動(dòng)脈壁內(nèi)皮細(xì)胞水腫、脫落，內(nèi)膜灶性增厚，中膜平滑肌細(xì)胞排列紊亂，內(nèi)膜-中膜厚度輕度增加，浸潤(rùn)于內(nèi)膜的炎性細(xì)胞數(shù)輕度增多；免疫組化顯示HU組主動(dòng)脈內(nèi)膜eNOS表達(dá)較對(duì)照組顯著減少， ET- 1和ICAM表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，且HU組血清NO較對(duì)照組顯著降低，ET- 1和ICAM較對(duì)照組顯著升高。

在高血脂、高血糖與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系的早期研究中，通過高脂、高糖動(dòng)物模型的建立，觀察高血脂、高血糖對(duì)動(dòng)脈的直接影響，為其致病機(jī)制提供了重要信息[4- 7]。但既往直接觀察單純高尿酸血癥對(duì)主動(dòng)脈的結(jié)構(gòu)影響的研究很少，可能原因推測(cè)如下：短期高尿酸血癥對(duì)主動(dòng)脈不可能產(chǎn)生明顯的變化，而長(zhǎng)期高尿酸血癥動(dòng)脈模型造模非常困難[8]。本研究建立的HU模型發(fā)現(xiàn)，其主動(dòng)脈的變化與早早期(糖尿病模型8周)時(shí)有些類似變化。

2015年，一項(xiàng)選用新西蘭白兔進(jìn)行的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，也發(fā)現(xiàn)了跟本研究類似的現(xiàn)象，看到了HU組內(nèi)膜的增厚，也未看到典型的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊[9]。其與本研究的不同之處在于內(nèi)膜厚度變化更顯著。分析該研究與本研究產(chǎn)生差異的原因如下:1)選用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物不同，該研究選用的動(dòng)物為新西蘭白兔，本研究選用的動(dòng)物為S-D大鼠，大鼠的體內(nèi)脂質(zhì)代謝過程與人類存在較大差距，可能不利于觀察到典型動(dòng)脈粥樣硬化表現(xiàn)[10- 11]。2)樣本量有所差異：該研究的每組動(dòng)物為12只，而本研究?jī)H為8只。

綜上所述，長(zhǎng)期單純高尿酸血癥(12周)本身，尚不足以引起大鼠主動(dòng)脈典型的動(dòng)脈粥樣硬化，但其能夠引起主動(dòng)脈的eNOS表達(dá)下降，ET- 1、ICAM表達(dá)增加。

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