徐 杉，王蕾杰，石 磊

(中國醫(yī)學科學院基礎(chǔ)醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎(chǔ)學院 生物化學與分子生物學系醫(yī)學分子生物學國家重點實驗室，北京100005)

Zika病毒為黃病毒屬、單股正鏈的RNA病毒。近幾年，Zika病毒的爆發(fā)嚴重危害了人類健康。研究發(fā)現(xiàn)，孕婦感染Zika病毒與新生兒小頭癥的發(fā)病率升高密切相關(guān)[1]。此外，Zika病毒會損害小鼠睪丸的發(fā)育[2]，從而影響生殖系統(tǒng)。因此，Zika病毒成為威脅人類健康的重大挑戰(zhàn)。Zika病毒侵入細胞后，其基因組RNA通過翻譯產(chǎn)生3種結(jié)構(gòu)蛋白(C蛋白、prM蛋白和E蛋白)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5)[3]。結(jié)構(gòu)蛋白作為病毒結(jié)構(gòu)的組成部分，參與病毒組裝；非結(jié)構(gòu)蛋白的協(xié)調(diào)作用在病毒蛋白成熟、基因組復制及病毒組裝中起著重要作用。

Zika病毒進入細胞后，病毒基因組(+)RNA首先在NS5 RNA聚合酶的作用下復制形成雙鏈RNA，該雙鏈RNA隨后被NS3解旋形成單鏈，NS5以(-)RNA為模板繼續(xù)進行復制，產(chǎn)生(+)RNA[4]。因此，研究Zika病毒NS3的ATP水解和核酸解鏈功能有助于闡明病毒復制機制，為抑制Zika病毒感染提供新的藥物設(shè)計思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株：trans5α感受態(tài)細胞(全式金生物技術(shù)公司)；BL21感受態(tài)細胞(自制)。

1.1.2 試劑：卡那霉素、IPTG、DTT和ATP(Amresco公司)；RNaseA(TaKaRa公司)；DNaseI(北京瑞達恒輝科技發(fā)展有限公司)；His抗體(EMAR公司)；ATPase檢測試劑盒(Bioassay Systems公司)；合成標記的DNA(cy3-GCGTCTTTACGGTGCTTAAAACAAA ACAAAACAAAACAAAA和AGCACCGTAAAGACG C-BHQ2)(梓熙生物技術(shù)有限公司)；PCR引物(北京擎科生物科技有限公司)；quick-change體系(Phanta公司)；質(zhì)粒小提試劑盒和膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司)；限制性內(nèi)切酶、CIP和T4 DNA連接酶(NEB公司)；Ni瓊脂糖珠子(Qiagen公司)。

1.2 方法

1.2.1 Zika NS3表達載體的構(gòu)建：50 μL PCR體系：模板100 ng，10 μmol/L引物1.5 μL，DNA聚合酶1 μL，dNTPs 4 μL，5×緩沖液10 μL，ddH2O補齊體積。NS3引物序列：上游為5′-CGGAATTCGGTGGC AGCGAGAACTTGTATTTCCAGGGAGGTGGTAGTGGA GCTCTATGGGATGTGC-3′，下游為5′-CCGCTCGAGT TACAGATCCTCTTCAGAGATGAGTTTCTGCTCTCTTT TCCCAGCGGCA-3′。PCR擴增程序為：95 ℃變性4 min，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸5 min，1個循環(huán)。反應結(jié)束后，PCR產(chǎn)物利用膠回收試劑盒回收?；厥盏漠a(chǎn)物與pET-28a載體均用EcoRⅠ和XhoⅠ雙酶切過夜。載體酶切后加入1 μL CIP酶，置于37 ℃消化1 h，然后進行電泳及膠回收；PCR產(chǎn)物酶切后直接回收?；厥蘸蟮妮d體和片段利用T4 DNA連接酶進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化trans5α感受態(tài)中，挑取單克隆菌落接菌，提取質(zhì)粒后測序。

1.2.2 NS3蛋白誘導表達：將NS3表達載體轉(zhuǎn)入BL21，挑取單克隆菌落于5 mL LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過夜后轉(zhuǎn)入1 L LB中，培養(yǎng)至OD600=1，加入終濃度為0.4 mmol/L 的IPTG。然后將菌置于16 ℃，150 r/min條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。誘導結(jié)束后，6 000 r/min，離心10 min收集菌體，-20 ℃保存。

1.2.3 NS3蛋白純化：使用30 mL裂解緩沖液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.5% Triton X- 100，20 mg/L RNaseA，20 mg/L DNaseI，10%甘油，1 mmol/L DTT，2 mmol/L PMSF，1 mg/L leupeptin，1 mg/L pepstatin，1 mg/L aprotinin)重懸菌體。冰上超聲裂解，總功率200 W，超聲5 s，停7 s，共超聲20 min。超聲結(jié)束后，4 ℃18 000 r/min離心45 min。取上清，加入Ni瓊脂糖珠子，4 ℃結(jié)合4 h后，離心后棄上清，將珠子轉(zhuǎn)移至柱子中，用含30 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，0.4 mmol/L DTT，30 mmol/L咪唑)洗2次，再用含60 mmol/L咪唑的洗滌緩沖液洗2次，然后加入洗脫緩沖液(500 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，500 mmol/L咪唑，1 mmol/L DTT)洗脫。最后，蛋白用2 L透析緩沖液(100 mmol/L NaCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 8.0，10%甘油，1 mmol/L DTT)透析過夜。

1.2.4 ATPase活性檢測：使用無色透明96孔板，參照試劑盒說明書進行實驗。先配制標準磷酸根溶液，用于制作標準曲線。然后將NS3用透析緩沖液稀釋成200 nmol/L，將ATP分別稀釋成2、1、0.4、0.32和0.2 mmol/L。實驗組反應體系為：20 μL反應緩沖液，10 μL酶，10 μL ATP，對照組用透析緩沖液代替酶。反應30 min后，每孔加入200 μL顯色液，30 min后使用酶標儀檢測A620。

1.2.5 核酸解鏈實驗：將合成的ssDNA用退火緩沖液(100 mmol/L KCl，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，2 mmol/L MgCl2)溶解，配成10 μmol/L母液。配制600 μL退火體系：30 μL cy3標記的核酸，30 μL BHQ2標記的核酸，退火緩沖液補齊。將體系避光放于95 ℃水浴中加熱5 min后，自然冷卻至室溫，即得到dsDNA。每個解鏈反應體系為100 μL，包含50 nmol/L退火產(chǎn)物，20 mmol/L Tris-HCl pH 7.4，10 mmol/L NaCl，0.1 g/L BSA，5 mmol/L MgCl2， 500 nmol/L NS3，混勻后加入全白不透明96孔板中。用酶標儀檢測溶液的熒光值[酶標儀參數(shù)：激發(fā)光550 nm，發(fā)射光620 nm，臨界值(cutoff值)610 nm]，待熒光值穩(wěn)定后，每孔加入終濃度為5 mmol/L的ATP以及500 nmol/L的競爭劑(GCG TCTTTACGGTG CT)，檢測熒光值的動力學變化。

1.2.6 利用quick-change獲得NS3 G198A表達載體：20 μL反應體系如下：模板200 ng，10 μmol/L引物1.5 μL(上游引物序列：5′-CTTGCATCCTGGAGCT GCAAAAACCAGGAGAGTTC-3′；下游引物序列：5′-G AACTCTCCTGGTTTTTGCAGCTCCAGGATGCAAG-3′)，phanta DNA聚合酶1 μL，dNTPs 1 μL，2×緩沖液10 μL，加ddH2O補齊體積。PCR程序為：95 ℃變性4 min，1個循環(huán)；95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸7 min，18個循環(huán)；72 ℃繼續(xù)延伸10 min，1個循環(huán)。反應結(jié)束后，加入DpnⅠ酶消化模板。然后將反應產(chǎn)物轉(zhuǎn)化trans5α。挑取單克隆，搖菌培養(yǎng)，提質(zhì)粒后測序。

2 結(jié)果

2.1 Zika NS3蛋白的表達和純化

Zika NS3原核表達克隆構(gòu)建成功后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21菌株，利用Western blot檢測Zika NS3蛋白在大腸桿菌的表達(圖1A)。然后用Ni瓊脂糖珠子對蛋白進行親和純化，得到較純的Zika NS3全長蛋白，其分子質(zhì)量約為80 ku，與理論計算的NS3分子量相符(圖1B)。

A.Western blot；B.Coomassie blue staining圖1 Zika NS3在大腸桿菌中的表達純化Fig 1 Expression and purification of Zika NS3 in E. coli

2.2 Zika NS3在體外具有ATP水解活性

Zika NS3水解ATP的結(jié)果以雙倒數(shù)曲線方程的形式呈現(xiàn)(圖2)。在該反應條件下，Zika NS3具有ATPase活性，其對ATP水解的最大反應速率為2.76 μmol/(L·min)，Km值為0.11 mmol/L。

圖2 Zika NS3在體外對ATP的水解活性Fig 2 ATP hydrolysis activity of Zika NS3 in vitro

2.3 Zika NS3在體外具有對dsDNA的解鏈活性

核酸解鏈系統(tǒng)利用FRET原理(圖3A)，將核酸單鏈末端分別帶上Cy3熒光基團和BHQ2淬滅基團，當二者退火形成雙鏈時，Cy3熒光被BHQ2吸收；當雙鏈被解開后，Cy3熒光被檢測到。實驗發(fā)現(xiàn)，相比不加蛋白的對照組，加入Zika NS3的實驗組隨著反應時間延長，Cy3熒光值顯著增加，解鏈發(fā)生(圖3B)。

A.system principle；B.dsDNA unwinding圖3 Zika NS3在體外對dsDNA的解鏈活性Fig 3 dsDNA unwinding activity of Zika NS3 in vitro

2.4 Zika NS3 G198A表達純化

Zika NS3 G198A突變體在大腸桿菌BL21中可以被較好的誘導表達。通過Ni柱親和純化可以得到較純的G198A蛋白(圖4)。

圖4 Zika NS3 G198A表達純化Fig 4 Expression and purification of Zika NS3 G198A

2.5 Zika NS3 G198A水解ATP的活性顯著降低

使用等量的Zika NS3野生型(WT)和G198A進行ATP水解反應，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G198A對ATP的水解速率顯著低于NS3 WT(圖5)。

2.6 Zika NS3 G198A對dsDNA的解鏈活性降低

使用等量的Zika NS3 WT和G198A進行dsDNA解鏈實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)G198A對dsDNA的解鏈速率明顯低于NS3 WT(圖6)。

圖5 Zika NS3WT與G198A對ATP水解活性比較Fig 5 Comparision of ATP hydrolysis activity between Zika NS3 WT and G198A

圖6 Zika NS3 WT與G198A對dsDNA解鏈活性比較Fig 6 Comparision of dsDNA unwinding activity between Zika NS3 WT and G198A

3 討論

除了Zika病毒，黃病毒還包括登革熱病毒和乙型腦炎病毒等。經(jīng)過長期研究，這些黃病毒NS3蛋白的結(jié)構(gòu)和功能已被廣泛熟知[5]。NS3蛋白N端蛋白酶(protease)結(jié)構(gòu)域主要發(fā)揮蛋白酶功能，通過切割病毒自身蛋白，幫助病毒成熟，此外還能切割宿主細胞免疫相關(guān)因子，幫助病毒存活[6- 7]。C端解旋酶(helicase)結(jié)構(gòu)域通過水解ATP供能，解旋雙鏈核酸[8]。NS3與NS5相互配合，共同實現(xiàn)病毒基因組的復制。但目前，對于Zika病毒NS3的研究主要局限在結(jié)構(gòu)方面，而對其功能的研究少有報道[9]。

在本研究中，首先通過大腸桿菌表達和親和純化，得到了Zika NS3蛋白。然后對Zika NS3本身的ATP水解活性和dsDNA的解旋活性進行了檢測。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Zika NS3同其他黃病毒NS3一樣[6]，在體外均具有ATP水解活性和dsDNA解旋活性，可以水解ATP并解鏈dsDNA。

黃病毒NS3對核酸的解鏈需要ATP水解供能。因此抑制NS3的ATP水解活性可以抑制其核酸解旋活性。已有研究發(fā)現(xiàn)，登革熱病毒NS3 G198A突變體的ATP水解活性和核酸解旋活性，相比野生型NS3均明顯減弱[10]。通過序列比對，將Zika NS3蛋白的該位點進行突變，得到Zika NS3 G198A突變體，并對其酶活性進行研究。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，同登革熱病毒NS3一樣，Zika NS3 G198A的ATP水解活性以及dsDNA的解旋活性均受到明顯抑制。經(jīng)分析，NS3 G198A通過抑制ATP水解進而抑制了dsDNA解鏈。之所以G198A對核酸解鏈的抑制效果低于對ATP水解的抑制效果，可能是由于實驗所用dsDNA雙鏈長度較短，只需要較少的ATP供能，便可以達到解鏈效果。

綜上所述，Zika NS3蛋白在體外具有ATP水解活性和dsDNA解旋活性，且NS3 G198A突變體通過影響NS3的ATP水解活性影響其對dsDNA的解鏈活性。該結(jié)果有助于闡明Zika病毒復制機制，為抑制Zika病毒感染提供新的思路。

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