朱又椰，楊 惠，曾佳玉，曹文宇，劉政海，萬 煒，何 潔*

(南華大學(xué) 醫(yī)學(xué)院 1.腫瘤研究所; 腫瘤細(xì)胞與分子病理學(xué)湖南省重點實驗室；2.解剖學(xué)教研室， 湖南 衡陽 421001)

溴結(jié)構(gòu)域結(jié)合蛋白4(bromodomain-containing protein 4，BRD4)是染色質(zhì)“閱讀者”，能夠與組蛋白上的乙酰化賴氨酸殘基相結(jié)合，從而調(diào)控基因的表達(dá)[1]。最近研究發(fā)現(xiàn)BRD4在腦內(nèi)廣泛表達(dá)，可以通過識別即早基因及突觸相關(guān)蛋白的乙?；稽c，影響基因轉(zhuǎn)錄，參與學(xué)習(xí)記憶的形成[2]，組蛋白乙?；c炎性疼痛也有關(guān)系[3]。但是BRD4在脊髓中的表達(dá)及其在疼痛中作用鮮見報道。因此，本研究首先檢測BRD4在小鼠脊髓后角中的細(xì)胞定位，然后通過建立甲醛疼痛模型，探討B(tài)RD4在炎性疼痛中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF二級雌性昆明小鼠，體質(zhì)量25～30 g [湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，合格證號：SYXK(湘)2015-0001]。

1.1.2 主要試劑：兔來源BRD4單克隆抗體和小鼠來源(NeuN)單克隆抗體(Abcam公司)；甲醛溶液(WellBiosciece公司)；吲哚美辛(大連美侖生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及處理：將小鼠隨機(jī)分為對照組(control組)、甲醛組(FM組)和甲醛+吲哚美辛組(FM+Indo組)，每組12只。FM組：小鼠予以右側(cè)后肢足底皮下注射25 μL 1%甲醛溶液；FM+Indo組：小鼠腹腔注射吲哚美辛(20 mg/kg)1 h后注射甲醛溶液。

1.2.2 疼痛行為學(xué)評分：注射1%甲醛溶液后，即刻放入有機(jī)玻璃箱內(nèi)，同時用攝像機(jī)觀察60 min小鼠舔咬右側(cè)后足的疼痛行為，并記錄每5 min內(nèi)動物舔咬右后足行為的持續(xù)時間，其持續(xù)時間與小鼠疼痛嚴(yán)重程度成正比[4]。

1.2.3 免疫組化檢測脊髓BRD4的表達(dá)：4%多聚甲醛灌注固定后取出脊髓腰骶膨大段(L4-L6)，固定24 h后梯度沉積，然后冰凍切片。3%的H2O2抑制內(nèi)源性過氧化物酶，5%羊血清封閉，加一抗(anti-BRD4，1∶1 000，) 4 ℃過夜；加生物素化山羊抗兔IgG二抗(1∶200)中室溫孵育2 h，加AB液(ABC kit，1∶200，Vector)，DAB顯色、晾干、脫水、透明和封片。最后在EVOS FL Auto顯微鏡下觀察并拍攝，計算BRD4免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞數(shù)。

1.2.4 免疫熒光檢測BRD4與NeuN的定位情況：選取對照組小鼠的脊髓切片4 ℃、5%驢血清封閉過夜，將兔來源BRD4單抗(1∶400)分別加入鼠來源NenN單抗(1∶500)、鼠來源GFAP單抗(1∶1 000)和鼠來源單抗Iba-1(1∶400)混合液中4 ℃ 孵育過夜； Alexa 488標(biāo)記的驢抗兔(1∶500)和Alexa 594標(biāo)記的驢抗鼠(1∶500)的混合液室溫避光孵育2 h；封片，置于顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.5 Western blot檢測BRD4的表達(dá)：取小鼠脊髓腰骶膨大段，加入200 μL組織蛋白抽提液，取上清液，用BCA法進(jìn)行蛋白濃度測定。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加特異性抗BRD4抗體(1∶200)和抗Tublin抗體(1∶2 000)，4 ℃孵育過夜；PBS-T 漂洗 10 min×3次，特異性二抗室溫孵育2 h；用PBS-T漂洗10 min×3次后在ECL成像系統(tǒng)中進(jìn)行顯影成像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 BRD4在小鼠脊髓中的表達(dá)及細(xì)胞定位

BRD4主要分布于小鼠脊髓后角淺層(板層Ⅰ～Ⅱ)區(qū)域，定位于神經(jīng)元(圖1)。結(jié)果顯示：BRD4主要表達(dá)在NeuN陽性神經(jīng)之中，BRD4與NeuN存在廣泛的共表達(dá)。

2.2 BRD4在甲醛疼痛模型小鼠脊髓中的表達(dá)變化

與對照組相比，甲醛組小鼠表現(xiàn)出明顯的雙相痛行為，其中第Ⅰ相痛出現(xiàn)在注射后0～5 min，第Ⅱ相痛出現(xiàn)在注射后10～40 min(圖2A)。與對照組相比，甲醛組雙側(cè)脊髓后角淺層(板層Ⅰ～Ⅱ)BRD4表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)(圖2B)。

2.3 吲哚美辛預(yù)處理對甲醛疼痛模型小鼠脊髓中BRD4的表達(dá)影響

吲哚美辛預(yù)處理可減輕甲醛誘導(dǎo)的第二相疼痛，并下調(diào)小鼠雙側(cè)脊髓BRD4的表達(dá)。與甲醛組相比，吲哚美辛干預(yù)組能明顯減輕甲醛誘導(dǎo)的第二相疼痛(P<0.05)(圖3A)。同時，顯著下調(diào)小鼠雙側(cè)脊髓BRD4表達(dá)(P<0.05) (圖3B)。

圖1 免疫熒光觀察BRD4在小鼠脊髓中的定位Fig 1 Observe the localization of BRD4 in the spinal cord of mice by immunofluorescence

A.licking time after injection of saline or formaldehyde for 1 hour; B.immunostaining of BRD4 in the left and right side of spinal cord horn；*P<0.05,**P<0.01 compared with the control group

A.the licking time after injection of saline or FM within 1 hour in each group; B.the immunostaining of BRD4 in the left and right side of spinal cord horn; C.protein expression of BRD4 in the left and right side of spinal cord horn;*P<0.05 compared with the FM or control group;**P<0.01,***P<0.001 compared with the control group;****P<0.0001,#P< 0.05 compared with the FM group;△P< 0.05 compared with the FM group

3 討論

BRD4作為一種重要的表觀遺傳學(xué)調(diào)控因子，能夠結(jié)合乙?；慕M蛋白，在炎性反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[5]。組蛋白乙酰化與炎性疼痛又密切相關(guān)，脊髓后角組蛋白去乙?；冈谕耆ナ献魟┱T導(dǎo)大鼠炎性痛模型中表達(dá)上調(diào)，其抑制劑可通過調(diào)控谷氨酸2受體，氨基丁酸的表達(dá)，從而發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[6]。脊髓是疼痛調(diào)節(jié)中樞，脊髓后角主要為與傳導(dǎo)感覺沖動有關(guān)的神經(jīng)元，其淺層在疼痛信息的傳遞過程中發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)功能[7]。那么BRD4在脊髓的表達(dá)情況如何，其與炎性痛的發(fā)生發(fā)展有什么關(guān)系呢？

本研究采用免疫熒光方法檢測了小鼠脊髓BRD4與神經(jīng)元NeuN，星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP和小膠質(zhì)細(xì)胞Iba-1的共表達(dá)情況，結(jié)果顯示，在脊髓后角淺層(板層Ⅰ～Ⅱ)中BRD4與NeuN存在明顯的共定位現(xiàn)象, 而與GFAP和Iba-1共定位表達(dá)較少。BRD4在成年小鼠全腦中均有表達(dá)，而且在皮質(zhì)和海馬中，BRD4與神經(jīng)元的標(biāo)志物NeuN有明顯的共表達(dá)，但是與膠質(zhì)細(xì)胞沒有共定位，進(jìn)一步，作者還分離培養(yǎng)了皮質(zhì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元中BRD4 mRNA和蛋白質(zhì)水平明顯高于膠質(zhì)細(xì)胞，以上結(jié)果提示BRD4主要表達(dá)在神經(jīng)元中，這與我們的研究結(jié)果一致。BRD4通過調(diào)節(jié)神經(jīng)元即早基因及突觸相關(guān)蛋白的基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)學(xué)習(xí)記憶[2]。提示我們，脊髓后角淺層(板層Ⅰ～Ⅱ)BRD4的表達(dá)，可能通過作用于該部位神經(jīng)元，參與炎性痛的調(diào)節(jié)。

甲醛疼痛模型是經(jīng)典的炎性痛模型，甲醛注射后小鼠出現(xiàn)典型的雙相疼痛。第二相痛與炎性反應(yīng)激活有關(guān)[4]。行為學(xué)結(jié)果表明我們成功復(fù)制了小鼠甲醛炎性痛模型。并且檢測到甲醛組小鼠雙側(cè)脊髓后角中BRD4的表達(dá)顯著高于對照組小鼠。提示BRD4表達(dá)與甲醛疼痛關(guān)系密切，機(jī)制可能與炎性反應(yīng)激活有關(guān)。右側(cè)足底注射會導(dǎo)致左側(cè)脊髓BRD4的表達(dá)變化的原因是左側(cè)和右側(cè)脊髓之間接收到的信號強(qiáng)度不一致[8]。

吲哚美辛是一種非甾體類抗炎藥物，可以通過促進(jìn)脊髓內(nèi)五羥色胺的釋放發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用[9-10]。本研究通過吲哚美辛治療緩解了甲醛誘導(dǎo)的第二相疼痛，證實了吲哚美辛可治療甲醛所致的炎性痛。進(jìn)一步檢測結(jié)果表明，吲哚美辛治療組小鼠脊髓后角BRD4的表達(dá)顯著弱于甲醛組。進(jìn)一步提示了BRD4表達(dá)參與了甲醛炎性疼痛。其機(jī)制可能是吲哚美辛通過抑制NF-κB 的激活從而抑制炎性反應(yīng)，而NF-κB的活性是BRD4能夠識別乙酰化的Rel A發(fā)揮轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用的重要因素[11-12]。

本研究基本確定，BRD4在小鼠脊髓后角淺層(板層Ⅰ～Ⅱ)主要定位于神經(jīng)元，在急性炎性疼痛中發(fā)揮重要作用。然而，BRD4的表達(dá)與脊髓后角炎性反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展的關(guān)系尚未完全闡明，有待進(jìn)一步研究?？傊?，BRD4與急性炎性疼痛關(guān)系密切，有望成為鎮(zhèn)痛藥物的新靶點。

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