高宇輝，鄧唯唯，魏春燕

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 病原學(xué)系， 北京 100005)

瘧疾是由蚊媒傳播瘧原蟲(chóng)感染而引起的寄生蟲(chóng)病，目前仍然是威脅人類(lèi)健康的3大傳染病之一。2016年大約2.16億人感染瘧疾，共有44.5萬(wàn)人死于瘧疾，99%死亡患者是受到惡性瘧原蟲(chóng)(Plasmodiumfalciparum)感染，其中5歲以下兒童的病死率占到70%(WHO World Malaria Report 2017)。研發(fā)出安全有效的瘧疾疫苗成為該公共健康領(lǐng)域的一項(xiàng)重要目標(biāo)，然而目前還沒(méi)有預(yù)防效果令人滿意的瘧疾疫苗上市。DNA疫苗是一種新型疫苗，可以激發(fā)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，相比傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)疫苗有諸多的優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于病原體感染、腫瘤及自身免疫病等疾病研究。在瘧疾疫苗研究方面，DNA疫苗也逐漸受到重視，兩項(xiàng)針對(duì)惡性瘧原蟲(chóng)子孢子/肝期的DNA疫苗已進(jìn)入到臨床研究階段，顯示了DNA疫苗在瘧疾研究領(lǐng)域良好的應(yīng)用前景[1- 2]。

惡性瘧感染在紅內(nèi)期發(fā)育階段導(dǎo)致臨床癥狀的發(fā)生，嚴(yán)重者可致死亡。針對(duì)惡性瘧紅內(nèi)期感染的疫苗可以抑制寄生蟲(chóng)血癥，減輕臨床癥狀，降低瘧疾病死率。本研究室前期研究基于惡性瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期多表位人工隨機(jī)重組蛋白疫苗編碼序列設(shè)計(jì)的核酸疫苗VR1012-ES312，在小鼠實(shí)驗(yàn)中顯示，其可以激發(fā)一定水平的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[3]。本研究將抗原與靶向樹(shù)突狀細(xì)胞(DCs)的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原- 4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4，CTLA- 4)胞外段融合表達(dá)，并在免疫時(shí)加入細(xì)胞因子佐劑，旨在探討是否能夠進(jìn)一步加強(qiáng)瘧疾DNA疫苗的免疫效力。

1 材料與方法

1.1 材料

HEK293細(xì)胞、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI- 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)和抗生素(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心)；DC2.4細(xì)胞(上?；鄯f生物科技有限公司)；引物合成和測(cè)序(Invitrogen公司)；限制性?xún)?nèi)切酶(NEB公司)；抗ES312- IgY抗體(本研究室制備)；HRP標(biāo)記的AntiChicken IgY(Promega公司)；HRP或FITC標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 表達(dá)載體構(gòu)建及質(zhì)粒提?。喝斯ず铣蓛啥藥в蠵stⅠ和SalⅠ位點(diǎn)的分泌肽tPA leader編碼序列連入VR1012質(zhì)粒，進(jìn)而與從質(zhì)粒VR1012-ES312經(jīng)SalⅠ/BglⅡ酶切得到的ES312表達(dá)框連接，構(gòu)建分泌型表達(dá)質(zhì)粒VR1012-sES312。使用引物sC4- 1/sC4- 2，以小鼠cDNA文庫(kù)為模板擴(kuò)增CTLA- 4胞外區(qū)，克隆入VR1012-sES312質(zhì)粒，得到融合抗原表達(dá)載體VR1012-sES312-CTLA。小鼠粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimu-lating factor,GM-CSF)序列通過(guò)引物CSF- 1/CSF- 2擴(kuò)增，克隆入VR1012載體，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒VR1012-GMCSF(圖1,表1)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及質(zhì)粒表達(dá)的檢測(cè): 轉(zhuǎn)染前24 h將HEK293細(xì)胞按1×105個(gè)/0.5 mL每孔接種于24孔板，轉(zhuǎn)染過(guò)程參照VigoFect轉(zhuǎn)染試劑盒(威格拉斯生物技術(shù)公司)說(shuō)明書(shū)操作，轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)60 h。Western blot 檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞上清液蛋白表達(dá)水平。即取VR1012-sES312轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清，并以VR1012空載體轉(zhuǎn)染的細(xì)胞蛋白抽提物以及VR1012-ES312轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液和細(xì)胞總蛋白抽提物為對(duì)照，行聚丙烯酰胺凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜，以Anti-M.RCAg- 1 IgY為一抗(1∶2 500稀釋)，HRP標(biāo)記的Anti-Chicken IgY為二抗(1∶20 000)孵育，化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。

1.2.3 CTLA結(jié)合實(shí)驗(yàn):參照文獻(xiàn)[4]方法，分別收集VR1012、VR1012-sES312以及VR1012-sES312-CTLA轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞培養(yǎng)60 h上清液；DC2.4細(xì)胞使用2% FBS/PBS(胎牛血清/磷酸鹽緩沖液)溶液洗滌2次，重懸于100 μL 2% FBS/PBS溶液中。加入100 μL HEK293細(xì)胞濃縮上清，室溫孵育1 h后洗滌，加入100 μL抗ES312-IgY抗體(1∶1 000)，室溫孵育1 h后洗滌。加二抗(Abcam Goat Anti-Chicken IgY H&L Alexa Fluor?488) (1∶500)，孵育30 min，洗滌后加入100 μL新鮮配制的2%甲醛/PBS固定5 min，流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)(FACS)檢測(cè)。

圖1 瘧疾DNA疫苗表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig 1 Schematic representation of the constructed malaria DNA vaccines

primersequence(5'-3') sC4-1CCCggatccGCTAGCGGCGGCGGCGGCAGCGGAGGAGGAGGAGAAGCCATACAGGTGACCCAACsC4-2GGAagatctTCAAGAATCCGGGCATGGTTCCSF-1ACGCgtcgacGCCGCCACCATGTGGCTGCAGAATTTACTTTTCCCSF-2CGCggatccTCATTTTTGGCCTGGTTTTTTGCATTC

Lowercase letters in the sequence are restriction enzyme sites; (GS)-linker sequence is shown in underline.

1.2.4 活體電穿孔免疫：SPF級(jí)6～8周雌性Balb/c小鼠，體質(zhì)量18～20 g(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所)，隨機(jī)分為6組：VR1012-ES312組、VR1012-sES312組、VR1012-sES312-CTLA組、VR1012-sES312+GM-CSF組、VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF組，以空載體VR1012為對(duì)照免疫組。每組免疫5只小鼠。核酸疫苗電穿孔免疫方法參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行操作，每種質(zhì)粒注射量50 μg/只小鼠，總共免疫4次，間隔兩周。

1.2.5 特異性IgG抗體、細(xì)胞因子檢測(cè)及間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)(IFA)：最后1次免疫結(jié)束后第10天收集小鼠血清和脾細(xì)胞。ELISA法測(cè)定血清抗體效價(jià)、ELISPOT法檢測(cè)細(xì)胞因子表達(dá)以及IFA檢測(cè)抗血清識(shí)別瘧原蟲(chóng)天然蛋白等操作均參照文獻(xiàn)[3]方法進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 VR1012-sES312-CTLA質(zhì)粒分泌表達(dá)

VR1012-sES312-CTLA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞培養(yǎng)上清出現(xiàn)約90 ku的特異條帶，與ES312-CTLA融合蛋白理論分子質(zhì)量大小相符；對(duì)照未融合CTLA的非分泌型VR1012-ES312質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在細(xì)胞總蛋白抽提物檢測(cè)到約65 ku大小的ES312蛋白條帶[5]，而在細(xì)胞培養(yǎng)上清中未檢測(cè)到ES312表達(dá)，表明VR1012-sES312-CTLA質(zhì)粒可以在真核細(xì)胞中正確表達(dá)并分泌ES312-CTLA融合蛋白(圖2)。

1.supernatant of VR1012-sES312-CTLA transfected cell culture; 2.extract from VR1012-ES312 transfected cell; 3.supernatant of VR1012-ES312 transfected cell culture; 4.extract from VR1012 transfected cell圖2 免疫印記檢測(cè)DNA疫苗載體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞表達(dá)的蛋白Fig 2 Immunoblotting detection of protein expressed by HEK293 cells transfected with DNA vaccine vectors

2.2 CTLA融合蛋白與DC2.4細(xì)胞親和性分析

與VR1012-sES312細(xì)胞培養(yǎng)上清相比，含有CTLA重組抗原蛋白的VR1012-sES312-CTLA細(xì)胞培養(yǎng)上清顯著增強(qiáng)了DC2.4細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度(MFI)的偏移，陽(yáng)性細(xì)胞率由7.67%提高到31.64%(圖3)。

圖3 轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞培養(yǎng)上清的蛋白結(jié)合表達(dá)B7的DC細(xì)胞Fig 3 Protein in supernatant of transfected HEK293 cells binding to B7-expressing DC cells

2.3 免疫后各組IgG效價(jià)和細(xì)胞免疫應(yīng)答檢測(cè)

免疫小鼠血清IgG抗體ELISA結(jié)果(圖4A)顯示，VR1012-sES312免疫組、VR1012-sES312-CTLA免疫組以及VR1012-sES312+GM-CSF共免疫組較之原設(shè)計(jì)非分泌型VR1012-ES312免疫組的抗體滴度均顯著提升，分別是VR1012-ES312免疫組的5倍、54.5倍和33倍(P<0.001)；VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF共免疫組相比單獨(dú)VR1012-sES312-CTLA免疫組或者VR1012-sES312+GM-CSF共免疫組抗體滴度也有明顯增加(P<0.01)；VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF共免疫組比VR1012-ES312免疫組抗體滴度提高190倍(P<0.001)。ELISPOT結(jié)果顯示，與對(duì)照VR1012-sES312實(shí)驗(yàn)組比較，VR1012-sES312-CTLA組以及VR1012-sES312+GM-CSF基因佐劑共免疫組均能顯著地促進(jìn)脾細(xì)胞IFN-γ和IL- 4細(xì)胞因子的分泌(P<0.001) (圖4B，C)。

2.4 免疫血清對(duì)瘧原蟲(chóng)天然抗原的識(shí)別

優(yōu)化設(shè)計(jì)改造后的DNA疫苗免疫血清仍然能夠識(shí)別惡性瘧原蟲(chóng)3D7株天然蟲(chóng)體抗原(圖5)，其中VR1012-sES312-CTLA+GM-CSF共免疫組識(shí)別天然抗原的IgG滴度高達(dá)1∶3 200，VR1012-sES312-CTLA免疫組識(shí)別滴度達(dá)1∶1 600，0.9%氯化鈉溶液與空載體VR1012免疫組對(duì)照組不識(shí)別天然抗原。

3 討論

DNA 疫苗是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的新型疫苗，導(dǎo)入機(jī)體后表達(dá)出抗原蛋白可通過(guò)MHC-Ⅰ以及MHC-Ⅱ途徑呈遞，激活CD4和CD8+T細(xì)胞，誘導(dǎo)產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫反應(yīng)[6]。DNA疫苗研究普遍采用導(dǎo)入肌肉組織中進(jìn)行免疫，但肌肉細(xì)胞并不是專(zhuān)職的抗原呈遞細(xì)胞(APCs)，無(wú)法引起強(qiáng)烈的特異性免疫應(yīng)答；由DCs將DNA編碼抗原呈遞給T細(xì)胞是DNA疫苗免疫反應(yīng)中的關(guān)鍵事件[7]。然而，組織中DCs占有核細(xì)胞總數(shù)的比例不到1%，且DNA疫苗經(jīng)普通的肌肉免疫途徑免疫小鼠，只有大約0.4%的DCs能夠被轉(zhuǎn)染[8]。這些因素使得DNA疫苗免疫效果尚不能完全令人滿意。

改善DNA疫苗的免疫效力的一種手段是直接將抗原靶向APCs。CTLA- 4表達(dá)在活化的T細(xì)胞表面，可以與抗原呈遞細(xì)胞(APC)表面的B7分子高親和力結(jié)合，將CTLA- 4編碼序列與抗原連接構(gòu)建的DNA疫苗免疫小鼠，在沒(méi)有佐劑的情況下即可增強(qiáng)體液和細(xì)胞免疫[9]。只保留細(xì)胞外CTLA- 4結(jié)構(gòu)域不影響其與受體分子結(jié)合的能力?？乖cCTLA- 4胞外區(qū)共表達(dá)， 尤其是在大動(dòng)物的DNA免疫實(shí)驗(yàn)中，可顯著增強(qiáng)DNA疫苗的免疫原性[10]。

A.IgG antibody titers detected by ELISA; B.IFN-γ secreting splenocytes from immunized mice; C.IL- 4 secreting splenocytes from immunized mice;*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001; SFC.spot forming cells

圖5 間接免疫熒光分析(IFA)DNA疫苗小鼠免疫血清抗體(1∶200稀釋)識(shí)別惡性瘧原蟲(chóng)體抗原

增強(qiáng)機(jī)體對(duì)DNA疫苗免疫應(yīng)答的另一種方法是加入分子佐劑，即在設(shè)計(jì)DNA疫苗時(shí)引入細(xì)胞因子、趨化因子或共刺激分子的編碼序列，即所謂的基因佐劑(genetic adjuvant)。GM-CSF是DNA疫苗研究中使用較多的一種基因佐劑。GM-CSF可以將APC招募到抗原處理部位，刺激骨髓DCs成熟，加強(qiáng)抗原特異性的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)。GM-CSF在臨床上的應(yīng)用也已經(jīng)證實(shí)是安全的，一項(xiàng)以GM-CSF為基因佐劑針對(duì)瘧原蟲(chóng)肝期的五價(jià)DNA疫苗臨床研究也表明，GM-CSF在人體應(yīng)用是安全可靠的[2]。

瘧疾感染者獲得保護(hù)性與感染早期IFN-γ以及Th2細(xì)胞介導(dǎo)的IL- 12、IL- 4反應(yīng)以及抗體類(lèi)別向IgG轉(zhuǎn)換密切相關(guān)[11]。前期工作中構(gòu)建了胞內(nèi)表達(dá)型惡性瘧原蟲(chóng)紅內(nèi)期瘧疾核酸疫苗[3]，為了進(jìn)一步提高DNA瘧疾疫苗經(jīng)肌肉途徑的免疫效力，本研究將DNA疫苗載體改造為分泌型表達(dá)，同時(shí)采用CTLA- 4靶向DCs的融合表達(dá)設(shè)計(jì)。結(jié)果顯示，分泌型DNA疫苗免疫小鼠明顯增強(qiáng)了細(xì)胞因子IFN-γ和IL- 4的分泌，說(shuō)明分泌型抗原增加了與APC細(xì)胞接觸的概率，能更有效的刺激細(xì)胞免疫；且CTLA- 4融合表達(dá)增加了抗原分子對(duì)局部DCs表面吸附能力，促進(jìn)了DCs攝取抗原的效率，進(jìn)一步加強(qiáng)了體液和細(xì)胞免疫。另一方面， GM-CSF對(duì)DNA疫苗免疫有顯著的刺激機(jī)體產(chǎn)生持久系統(tǒng)免疫反應(yīng)的佐劑效應(yīng)[12]，本研究結(jié)果也顯示，在GM-CSF的基因佐劑的參與下，可明顯增強(qiáng)DNA疫苗的免疫應(yīng)答，游離瘧疾抗原在CTLA- 4靶向作用以及GM-CSF的基因佐劑共同作用下，抗體滴度提高了190倍。

本研究改造了原有瘧疾DNA疫苗設(shè)計(jì)，使得抗原表達(dá)后分泌到細(xì)胞外并靶向DC細(xì)胞。同時(shí)采用基因佐劑GM-CSF共同免疫的策略，大大促進(jìn)了體液和細(xì)胞免疫水平，顯著增強(qiáng)了DNA疫苗的免疫效力，為研制有效的瘧疾DNA疫苗提供了新的思路。

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