古麗尼格爾·雪合拉提，王延蛟，祖力皮喀爾·阿卜杜熱合曼，娜孜拉木·玉蘇甫江，斯坎德爾·白克力

(新疆醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 生物化學與分子生物學教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

中國是食管癌發(fā)病率和病死率較高的地區(qū)[1]，全國發(fā)病率占第6位，病死率占第4位。與此同時，食管癌也是新疆地區(qū)人群中最常見的惡性腫瘤，病死率達 155.9/10 萬[2]。然而，當患者確診時，病程往往已經(jīng)發(fā)展為進行性吞咽困難并出現(xiàn)惡病質癥狀，5年生存率低于15%[2]。因此，尋找食管癌特異性較強、靈敏度高的血清標志物，提高其早期診斷率并改善患者預后是目前食管癌領域中迫切需要解決的問題。

microRNAs(miRNAs)通過促進或抑制來調(diào)節(jié)靶基因的表達， 其表達水平發(fā)生紊亂是誘發(fā)一系列腫瘤形成的重要因素，同時miRNAs也可作為腫瘤標志物用于食管癌、肝癌等惡性腫瘤的診斷和預后評估，并有望在食管癌的早期診斷方面取得進展，成為食管癌治療靶點[3]。

本實驗通過miRNA芯片分析篩選患者外周血單一miRNA候選指標，并用RT-qPCR法進行檢測和比較，探討其對食管癌的診斷和預后評估的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料：收集2013年4月至2013年12月在新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院就診或住院治療的36例食管癌患者，其中男24例，女12例，平均年齡64；并選取26名健康志愿者。所有食管癌患者均符合食管癌的臨床診斷標準，并經(jīng)病理學檢查確診。患者一般資料之間相比無差異，具有可比性，設置健康志愿者為對照組。食管癌組患者均經(jīng)病理學檢查確診并符合診斷標準，入選對象年齡范圍48～71歲，性別和民族不限；患者無其他位置腫瘤；實驗前未經(jīng)放化療以及相關抗腫瘤藥物治療；所有患者無心血管疾病以及腎功能不全；所有患者平素身體狀況較好，無感染性疾病及血液系統(tǒng)疾病；食管癌患者和健康志愿者均同意實驗措施，并簽署知情同意書。不符以上條件患者均排除實驗對象。此研究經(jīng)倫理委員會批準。

1.1.2 試劑：miRNAs反轉錄試劑盒(Qiagen公司)；熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司);引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

內(nèi)參U6引物序列：上游引物：5′-GCTTCGGCA CATATA-3′；下游引物：5′-CGAATTTGCGTGTCATC CTT-3′；miR-181b-5p引物序列：上游引物：5′-AA CACGCAACATTCATTGCTG-3′；下游引物：5′-GTCG TATCCAGTGCAGGGT-3′。

1.2 方法

委托北京博奧生物有限公司對白細胞總RNA的miRNA芯片篩查分析，并篩選差異表達候選單一miRNA，RT-qPCR法進行檢測比較。收集全血樣本3 mL，靜置，3 000 r/min離心10 min。Trizol法提取外周血白細胞總RNA，按照試劑盒說明反轉錄合成cDNA，并進行RT-qPCR實驗，結果以2-ΔΔCt法進行計算。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

食管癌組患者外周血白細胞miR-181b-5p表達水平明顯低于正常對照組(P<0.01)(圖 1)。

*P<0.01 compared with control圖1 正常對照組與癌組的miR-181b-5p表達水平Fig 1 Expression of miR-181b-5p in control group

miR-181-a和內(nèi)參基因U6的RT-qPCR實驗結果(圖2)，均出現(xiàn)特異的單峰，曲線整齊可信。

3 討論

食管癌是惡性腫瘤之一，具有早期診斷難、預后差等特點。中國是食管癌的高發(fā)國家，食管癌目前的診斷率仍然很低，且對食管癌的治療方法仍以手術為主，患者術后的 5年總生存率僅為 15%[4]。近年來，腫瘤標志物在腫瘤的早發(fā)現(xiàn)、腫瘤的篩查、腫瘤的診斷及鑒別診斷、腫瘤的分期、腫瘤的檢測和預后判斷等方面發(fā)揮著重要作用。miRNA的異常表達可能與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關[5]，研究腫瘤患者外周血液中特異性miRNAs，既可以探索其在腫瘤發(fā)病機理中的作用，也可以用于腫瘤早期診斷的血清標志物的篩查，實現(xiàn)腫瘤的“早發(fā)現(xiàn)，早治療”。miRNAs廣泛存在于生物體內(nèi)，是一類內(nèi)源性非編碼的單鏈小分子 RNA，在調(diào)節(jié)細胞功能，在個體發(fā)育、細胞凋亡、代謝以及疾病的發(fā)生方面發(fā)揮著重要的作用[8]。miRNAs表達異常的現(xiàn)象普遍存在于多種腫瘤中，已經(jīng)有研究報道，miRNAs通過調(diào)控多種信號通路直接或間接參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。

A.dissociation curre 1; B.amplification curre; C.dissociation curre 2圖2 U6與miR-181b-5p的熔解曲線和擴增曲線Fig 2 Dissociation curve，amplification curve of U6 and miR-181b-5p

本研究通過miRNA芯片分析篩選食管癌患者外周血差異表達的miR-181b,探討其在食管癌中的診斷和預后中的意義。miR 181家族有4個成員：miR-181(a、b、c、d)。經(jīng)數(shù)據(jù)庫(miRNA.org)分析預測，它們有相同的靶基因：INPP4B和PHLPP2。INPP4B基因通過抑制PI3K/AKT信號傳導通路，從而調(diào)控細胞增殖和血管生成等過程，是一種新發(fā)現(xiàn)的潛在腫瘤抑制因子。INPP4B基因在胃癌患者外周血[6]、前列腺癌[7]、結腸癌及乳腺癌[8]中的表達水平均下調(diào)，但在食管癌中的研究不多。PHLPP2是[9]新發(fā)現(xiàn)的抑癌基因，其主要功能抑制AKT通路，促進細胞凋亡和抑制細胞增殖，它的異常表達與卵巢癌[10]和肺癌[11]相關。

本研究結果顯示，食管癌患者外周血中miR-181b-5p的表達水平明顯低于健康志愿者，與報道[12]中通過表達上調(diào)抑制細胞增殖的結果相一致。推測miR-181b-5p在食管癌中可能有新的作用靶點，也可能在食管癌中的低表達是促癌作用的表現(xiàn)。因此，miR-181b-5p可否有望成為食管癌患者新的特異性診斷指標或預后評估指標，甚至是有效的臨床治療靶點，尚待進一步深入研究。

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