王玉平，韓國(guó)柱，武國(guó)宇，于 萍，呂 莉*，王繼紅

(1.遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,遼寧 大連 116029；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥理教研室，遼寧 大連 116044，大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部,遼寧 大連 116000)

rLj-RGD3是源于日本七鰓鰻口腔腺，通過(guò)基因工程技術(shù)獲得的由118個(gè)氨基酸組成、分子量為1.35×105的含有3個(gè)RGD模體的重組日本七鰓鰻毒素肽[1]。研究發(fā)現(xiàn)，rLj-RGD3憑借其RGD模體與活化的血小板內(nèi)皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞及新生血管內(nèi)皮細(xì)胞表面高表達(dá)的整合素(integrin)靶向結(jié)合，而具有抑制血小板聚集、腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移及抗血管新生等典型的RGD毒素蛋白功能[2-6]，但其藥代動(dòng)力學(xué)方面的研究少見(jiàn)報(bào)道。本研究采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫法(ELISA)，研究皮下注射rLj-RGD3在大鼠體內(nèi)的血漿藥代動(dòng)力學(xué)，為其新藥研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

rLj-RGD3粉針劑，20 mg/瓶，HPLC測(cè)定純度>97%，批號(hào)20160807，由遼寧師范大學(xué)提供；ELISA試劑盒，批號(hào)08032016，南京，金斯瑞生物科技公司產(chǎn)品。

MODEL550型酶標(biāo)儀，美國(guó)BIORAD公司產(chǎn)品。3P97藥代動(dòng)力學(xué)計(jì)算軟件，中國(guó)藥理學(xué)會(huì)數(shù)學(xué)專業(yè)委員會(huì)研制。

SD大鼠，雄性，(200±20)g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(遼)2002-0002，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK(遼)2002-0005。喂標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取大鼠空白血漿，以樣品稀釋液稀釋1000倍獲得血漿樣品稀釋液。用此血漿樣品稀釋液稀釋rLj-RGD3標(biāo)準(zhǔn)品(0.95 g/L)，配制1 mg/L rLj-RGD3標(biāo)準(zhǔn)母液，再以血漿樣品稀釋液倍比稀釋標(biāo)準(zhǔn)母液至rLj-RGD3終濃度為1600、800、400、200、100、50、0 μg/L的生物樣品標(biāo)準(zhǔn)溶液，以制備生物樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)處理

取SD大鼠15只，按給藥劑量隨機(jī)分為3組(n=5)，置于標(biāo)準(zhǔn)條件自由飲水進(jìn)食適應(yīng)3 d后，皮下注射rLj-RGD3，劑量為30、75、150 μg/kg，自由飲水。于給藥前及給藥后5、10、15、30、45、60、90、120、150、180、240及300 min自大鼠眼內(nèi)眥靜脈取血13次，每次0.2 mL，采用3.8%枸櫞酸鈉(體積比9∶1)抗凝，3000 r/min離心10 min獲得血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ脮r(shí)室溫溶解并以樣品稀釋液10～1000倍適當(dāng)稀釋，采用ELISA法檢測(cè)各血漿樣品中rLj-RGD3血藥濃度C(C=Cd×N，C為血藥濃度，Cd為稀釋后的藥物濃度，N為稀釋倍數(shù))，繪制平均血漿藥物濃度-時(shí)間曲線，并采用3P97軟件擬合房室模型及計(jì)算藥代參數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

取標(biāo)準(zhǔn)溶液及血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液同時(shí)進(jìn)行ELISA法測(cè)定，重復(fù)5次，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，濃度C為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，制備絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線和血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖1A。絕對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線及血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程分別為y=0.001 4x+0.028 7，R=0.996 0及y=0.001 1x+0.032 8，R=0.999 0。

2.2 大鼠皮下注射不同劑量rLj-RGD3后血漿藥-時(shí)曲線

按照1.3項(xiàng)下方法進(jìn)行大鼠血漿藥動(dòng)學(xué)的研究，ELISA法測(cè)定的OD值，經(jīng)隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血藥濃度，繪制平均血藥濃度(C)-時(shí)間(T)曲線如圖1B，將血藥濃度用3P97軟件計(jì)算出相應(yīng)藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表1。

表 1 rLj-RGD3在大鼠血漿中的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

注:T1/2ka吸收半衰期,T1/2α分布半衰期,T1/2β消除半衰期,V/Fc表觀分布濃度,AUC藥時(shí)曲線下面積,CLs血漿總清除率,Tpeak最高血藥峰時(shí)間,Cmax藥峰濃度

3 討 論

目前對(duì)蛋白多肽類藥物藥代動(dòng)力學(xué)的研究常采用同位素標(biāo)記法、免疫測(cè)定法及生物測(cè)定法等方法進(jìn)行藥物濃度的測(cè)定[7]。其中免疫測(cè)定法包括放射免疫測(cè)定法、免疫放射定量法、ELISA等。而ELISA法因具有檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性好、選擇性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，首選用于蛋白多肽類藥物的檢測(cè)。本研究即是采用了ELISA法研究rLj-RGD3的藥代動(dòng)力學(xué)。

本研究結(jié)果表明，皮下注射3種劑量rLj-RGD3后，吸收迅速，達(dá)峰時(shí)間26 min左右，不隨劑量改變而發(fā)生顯著變化。3P97程序擬合房室模型符合二室模型。在30、75、150 μg/kg下，Cmax分別為(1.45±0.21)、(3.68±0.25)、(7.86±0.47)μg/mL；T1/2β、CLs不隨劑量的改變而發(fā)生顯著改變；AUC與劑量成正比。提示，皮下注射rLj-RGD3在30～150 μg/kg劑量范圍內(nèi)，呈線性藥代動(dòng)力學(xué)。

研究結(jié)果可知，SC rLj-RGD3的T1/2ka為10 min左右，說(shuō)明皮下給藥吸收很快。但皮下注射后藥物的半衰期時(shí)間卻長(zhǎng)達(dá)85 min左右(P>0.05)，其可能的原因是皮下注射后藥物進(jìn)入血液需要一段時(shí)間，使得藥物在體內(nèi)分布達(dá)到平衡狀態(tài)后血漿藥物濃度降低一半所需要的時(shí)間，即半衰期較長(zhǎng)。

綜上，大鼠皮下注射rLj-RGD3吸收迅速，其血漿藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)顯示為線性動(dòng)力學(xué)。

參考文獻(xiàn)：

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[2] WANG J H,HAN X X,YANG H,et al.A novel RGD-toxin protein,Lj-RGD3,from the buccal gland secretion of Lampetra japonica,impacts diverse biological activities[J].Biochimie,2010,92(10):1387-1396.

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[5] 張丕橋,王繼紅,劉欣,等.重組七鰓鰻細(xì)胞毒素蛋白rLj-RGD3表達(dá)及對(duì)Hela細(xì)胞活性的影響[J].生物工程學(xué)報(bào),2009,25(5):686-694.

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