李廣廣，馬 勇，郭 楊，戴國(guó)達(dá)，蔡建平，黃桂成△

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)骨傷研究所， 南京 210029； 2.無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院，江蘇 無(wú)錫 214000)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)是一種常見(jiàn)的關(guān)節(jié)疾病，是導(dǎo)致中老年患者殘疾的主要原因之一[1]，它以軟骨破損、骨贅形成及滑膜炎性改變?yōu)橹饕±肀憩F(xiàn)[2]。隨著人口老齡化的發(fā)展，OA將極大地加重社會(huì)醫(yī)療負(fù)擔(dān)[3-4]。OA的病因病機(jī)復(fù)雜多樣，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)難以準(zhǔn)確闡明。目前對(duì)OA的治療以緩解疼痛、抗炎等控制癥狀為主，且長(zhǎng)期服用會(huì)帶來(lái)諸多不良反應(yīng)[5]。中醫(yī)藥對(duì)OA治療具有療效全面和安全可靠的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。

蔡建平主任醫(yī)師從醫(yī)多年，結(jié)合自身臨床經(jīng)驗(yàn)創(chuàng)立經(jīng)驗(yàn)方通絡(luò)治痹湯，該方具有祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)之功效[6]，臨證中常以該方加減治療膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)療效顯著[7]。為進(jìn)一步研究該方的作用機(jī)制，本研究通過(guò)改良Hulth法構(gòu)建兔KOA模型[8-9]，觀察通絡(luò)治痹湯能否抑制KOA兔模型炎癥反應(yīng)并對(duì)軟骨產(chǎn)生的修復(fù)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組

健康成年新西蘭白兔24只，體質(zhì)量2.0～2.5 kg，由南京市江寧區(qū)青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供(許可證號(hào)SCXK(蘇)2012-0008，合格證號(hào)201611476)。依據(jù)隨機(jī)分配原則分為假手術(shù)組(A組)、模型組(B組)、藤黃健骨丸組(C組)及通絡(luò)治痹湯組(D組)各6只。

1.2 主要試劑及儀器設(shè)備

蘇木素染液、伊紅染液，IL-1β、TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒(南京建成科技有限公司)；石蠟切片機(jī)(Leica，RM2245)；組織包埋機(jī)(Leica，EG1150H/C)；生物顯微鏡(Leica，：DM1000)。

1.3 模型建立

對(duì)A組的新西蘭白兔，打開(kāi)關(guān)節(jié)腔后直接縫合。其余各組予以改良Hulth法建立膝骨關(guān)節(jié)炎模型。術(shù)后連續(xù)5 d，慶大霉素0.4MU/d臀大肌肌注，預(yù)防感染。

1.4 藥物制備及干預(yù)處理

依據(jù)《中藥藥理研究方法學(xué)》劑量估換計(jì)算公式：dB=dA×KB/KA[10]，將成人每日服藥量(通絡(luò)治痹湯組成：紅花、地鱉蟲(chóng)、地龍、獨(dú)活、川芎、白芥子、牛膝、徐長(zhǎng)卿、五加皮、雞血藤；藤黃健骨丸，國(guó)藥準(zhǔn)字Z20026563，均由無(wú)錫市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科提供)折算為實(shí)驗(yàn)兔每日服藥量。將通絡(luò)治痹湯煎煮濃縮、藤黃健骨丸研磨溶于水，并定容為10 ml/kg·d-1。造模成功后，C組與D湯組分別給予10 ml/kg·d-1藥物溶液灌胃，A組與B組分別給予10 ml/kg·d-1生理鹽水灌胃，持續(xù)8周。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)與方法

1.5.1 Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)估級(jí)別 觀察實(shí)驗(yàn)兔膝關(guān)節(jié)局部疼痛刺激反應(yīng)、步態(tài)改變、關(guān)節(jié)活動(dòng)以及關(guān)節(jié)腫脹情況，并應(yīng)用Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)估方法[11]予以評(píng)價(jià)。

1.5.2 大體形態(tài)及組織學(xué)觀察 治療結(jié)束后，解剖各組實(shí)驗(yàn)兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)，肉眼觀察關(guān)節(jié)軟骨光滑度、色澤、表面是否有糜爛及潰瘍等。用刀片切取股骨內(nèi)側(cè)髁軟骨，4%多聚甲醛固定后制作石蠟切片，蘇木精-伊紅染色(HE染色)，光鏡下觀察后行Mankin’s評(píng)分[12]。

1.5.3 酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè) 頸總動(dòng)脈取血20 ml，靜置2 h后離心(4 ℃，2000 r /min，30 min)獲得兔血清，分裝于Eppendorf管中，-80 ℃保存。

耳緣靜脈麻醉后，沿右膝髕上囊剪開(kāi)約0.5 cm切口，1 ml生理鹽水分3次灌洗關(guān)節(jié)腔，收集關(guān)節(jié)液置于Eppendorf管中，離心(4 ℃，4000 r /min，10 min)后獲取上清液，-20 ℃ 保存。按照酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒使用說(shuō)明書(shū)分別檢測(cè)實(shí)驗(yàn)兔血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β與TNF-α的含量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 Lequesne MG行為學(xué)觀察

表1顯示，與A組比較其余各組Lequesne MG評(píng)分顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與B組比較，C組及D組評(píng)分均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 新西蘭白兔Lequesne MG膝關(guān)節(jié)評(píng)估級(jí)別

注：與假手術(shù)組比較：#P<0.05；與模型組比較：*P<0.05。Kruskal-Wallis分析結(jié)果：局部反應(yīng)=17.882，P=0.0009；步態(tài)改變=16.419，P=0.001；關(guān)節(jié)活動(dòng)=16.480，P=0.001；關(guān)節(jié)腫脹=14.987；P=0.002

2.2 軟骨大體形態(tài)觀察

圖1所示，兔膝關(guān)節(jié)A組軟骨表面光滑，色澤明亮呈淡粉色，未見(jiàn)裂紋、纖維化及軟化等，軟骨邊緣整齊，無(wú)骨贅形成(圖A)；B組軟骨表面凹凸不平，色澤灰暗無(wú)光，可見(jiàn)局部裂紋及纖維化，軟骨邊緣毛糙，有骨贅形成(圖B)；C丸組軟骨表面略粗糙呈藍(lán)白色，內(nèi)外側(cè)髁處可見(jiàn)局部纖維化，內(nèi)側(cè)髁底部可見(jiàn)局部潰瘍，軟骨邊緣有輕微骨贅形成(圖C)；D組軟骨表面略毛糙，顏色介于淡粉色與藍(lán)白色之間，內(nèi)側(cè)髁處粗糙，外側(cè)髁不明顯，局部可見(jiàn)裂紋及軟骨軟化(圖D)。

圖1 各組關(guān)節(jié)軟骨大體觀察圖注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藤黃健骨丸組；D.通絡(luò)治痹湯組

2.3 軟骨組織學(xué)觀察及Mankin’s評(píng)分

圖2顯示，A組軟骨表面光滑，細(xì)胞排列規(guī)則，層次有序，分布正常，染色正常，潮線清晰(圖A)；B組軟骨表面破損，軟骨層大片脫落未見(jiàn)軟骨，潮線模糊、斷裂(圖B)；C組軟骨面率粗糙，軟骨層小部分缺失，軟骨細(xì)胞群集現(xiàn)象減輕、排列輕微紊亂，潮線染色較淺，輕度失染(圖C)；D組軟骨面略毛糙，軟骨層局部修復(fù)，軟骨細(xì)胞局部群集、深染，潮線輕度模糊(圖D)。

表2顯示，軟骨組織Mankin’s評(píng)分顯示，與A組比較其余3組評(píng)分均明顯增高(P<0.05)，與B組比較，C組及D組評(píng)分均明顯下降(P<0.05)。

2.4 ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α表達(dá)

表2顯示，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔血清及關(guān)節(jié)液中IL-1β及TNF-α水平進(jìn)行ELISA檢測(cè)后，與A組比較，其余3組的IL-1β及TNF-α水平明顯升高(P<0.05)。血清中D組與B組比較，IL-1β及TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)，C組僅TNF-α水平較模型組有明顯改變(P<0.05)。而關(guān)節(jié)液中C組與D組的IL-1β及TNF-α水平均明顯降低(P<0.05)。

圖2 各組關(guān)節(jié)軟骨HE染色(100×)光鏡觀察圖注：A.假手術(shù)組；B.模型組；C.藤黃健骨丸組；D.通絡(luò)治痹湯組

表2 各組關(guān)節(jié)軟骨Mankin’s評(píng)分結(jié)果及ELISA檢測(cè)IL-1β、TNF-α水平比較

注：與假手術(shù)組比較：#P< 0.05；與模型組比較：*P< 0.05

3 討論

OA屬于中醫(yī)骨痹范疇?！端貑?wèn)·長(zhǎng)刺節(jié)論》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹?！标P(guān)節(jié)疼痛、麻木不仁、難以屈伸是OA的常見(jiàn)表現(xiàn)。如《素問(wèn)·痹論》：“痹在于骨則重……在于筋則屈不伸?！辈探ㄆ秸J(rèn)為“肝腎不足、經(jīng)絡(luò)痹阻”是OA的根本病機(jī)，但OA發(fā)病時(shí)患者疼痛難忍，嚴(yán)重影響生活質(zhì)量，因而標(biāo)本兼治，以“祛風(fēng)除濕，化瘀通絡(luò)”為治則，擬方通絡(luò)治痹湯。方中地鱉蟲(chóng)化瘀通絡(luò)、消腫止痛；獨(dú)活祛風(fēng)除濕、通痹止痛共為君藥；配川芎祛風(fēng)止痛、活血行氣；紅花活血通經(jīng)、祛瘀止痛；雞血藤養(yǎng)血活血補(bǔ)血、止痛舒筋活絡(luò)；五加皮祛風(fēng)濕、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，四者共為臣藥。佐以徐長(zhǎng)卿祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)通絡(luò)，白芥子豁痰利氣、散結(jié)通絡(luò)止痛，地龍通經(jīng)行絡(luò)，牛膝活血通經(jīng)、補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨，引諸藥下行，諸藥合用共奏祛風(fēng)除濕、化瘀通絡(luò)、培補(bǔ)肝腎之效，對(duì)OA患者關(guān)節(jié)僵硬、酸痛等癥狀有標(biāo)本同治之妙。藤黃健骨丸是國(guó)醫(yī)大師劉柏齡教授多年的臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)所制成的中藥復(fù)方制劑，在治療OA的臨床應(yīng)用中效果顯著，因而被選為陽(yáng)性對(duì)照藥物。

關(guān)節(jié)軟骨的退化與損傷是導(dǎo)致OA發(fā)生的首要因素。OA發(fā)生時(shí)軟骨退化或損傷將改變軟骨表面，關(guān)節(jié)軟骨因而受力異常進(jìn)而刺激軟骨細(xì)胞等發(fā)生炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生大量炎癥因子如IL-1β、TNF-α等[13]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，在OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織及滑液中，IL-1β、TNF-α水平明顯增高[14]。同時(shí)IL-1β與TNF-α是誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞降解的始動(dòng)因子，能夠刺激基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)、聚蛋白多糖(ADAMTS)等組織破壞酶的產(chǎn)生，導(dǎo)致軟骨細(xì)胞肥大及細(xì)胞終末分化等細(xì)胞異化作用直接參與對(duì)軟骨的破壞[15]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的異化活動(dòng)將導(dǎo)致細(xì)胞基質(zhì)重建，軟骨構(gòu)成物丟失，軟骨鈣化、龜裂并引起軟骨細(xì)胞增殖、群集，從而導(dǎo)致軟骨面更加粗糙，軟骨厚度變薄及纖維化[16]。因此課題組認(rèn)為，關(guān)節(jié)軟骨退化與炎癥因子是OA發(fā)生的2個(gè)主要原因，且兩者互為因果，不斷刺激OA的發(fā)生發(fā)展，使病情持續(xù)惡化，最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)僵硬、功能障礙。

既往研究認(rèn)為，OA的發(fā)生是由抗炎因子與促炎因子的失衡導(dǎo)致，局部組織中炎癥因子增多引起軟骨退變[17]，過(guò)多地肯定了炎癥因子的作用，而忽視了軟骨退變的作用。對(duì)炎癥因子與軟骨退變間的影響，往往認(rèn)為是一方主導(dǎo)另一方的改變。

但實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，A組膝關(guān)節(jié)表面光滑未見(jiàn)裂紋、纖維化及軟化等，軟骨細(xì)胞排列有序，無(wú)異常群集或增殖；而造模8周后表面凹凸不平，局部可見(jiàn)裂紋及纖維化，軟骨細(xì)胞異常群集、排列無(wú)序；中藥干預(yù)后，局部逆轉(zhuǎn)軟骨的鈣化、纖維化等，改善軟骨細(xì)胞的異化作用。與此同時(shí)，B組實(shí)驗(yàn)兔關(guān)節(jié)液中IL-1β、TNF-α水平顯著增高，而C組及D組水平明顯下降，且與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兔血清中IL-1β、TNF-α水平也表現(xiàn)出與關(guān)節(jié)液中相一致的結(jié)果，進(jìn)而說(shuō)明中藥復(fù)方具有多靶點(diǎn)、多機(jī)制的作用，能夠從整體著手調(diào)節(jié)人體的生理病理。以上研究結(jié)果表明，炎癥因子的表達(dá)量與軟骨面的改變存在一定的正向相關(guān)性。所以通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，軟骨面的改變與炎癥因子之間存在相互作用。軟骨面遭到破壞，導(dǎo)致血管、裂紋及微裂隙數(shù)量的增加，進(jìn)而擾亂軟骨與軟骨下骨之間的分子交互作用。同時(shí)，炎性因子的活躍不斷刺激軟骨，導(dǎo)致軟骨鈣化、纖維化等，由此形成一個(gè)持續(xù)的“惡性循環(huán)”。

基于以上研究結(jié)果，筆者認(rèn)為“通絡(luò)治痹湯”能夠抑制炎癥反應(yīng)，延緩軟骨退化，促進(jìn)軟骨修復(fù)，改善關(guān)節(jié)生理功能。但本實(shí)驗(yàn)仍存在一定的不足，對(duì)于其修復(fù)軟骨面的作用機(jī)制尚不清楚。故本課題組將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中深入研究，并通過(guò)體外研究方式，找出“通絡(luò)治痹湯”的抗OA作用機(jī)制。

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