張俊榮 王少為 楊 澤

阿爾茨海默病(AD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一,它包括早發(fā)型AD和晚發(fā)型AD(LOAD)[1～3]。根據(jù)以往的研究，95%的AD患者為晚發(fā)型AD[4，5]。LOAD的標志是淀粉樣β(Aβ)在腦實質和腦血管中的沉積,伴隨進行性認知下降。LOAD發(fā)生的詳細病因尚不明確，已知遺傳和環(huán)境因素共同起著重要的作用。ApoEε4等位基因,是唯一一個無可爭辯的遺傳因素[6，7]，除了年齡增長之外，環(huán)境風險因素包括吸煙、酒精、肥胖、高血壓、血脂異常、糖尿病和心血管疾病等都可能導致LOAD[8，9]。全基因組關聯(lián)研究識別到ATP結合轉運A7(ABCA7)作為LOAD的易感性位點，與LOAD相關的ABCA7單核苷酸多態(tài)性(SNPs)調節(jié)了LOAD發(fā)生的風險[10～15]。

ABCA7是ATP結合轉運家族的成員,主要參與脂質運輸和穩(wěn)態(tài)。其高度同源的家族成員ABCA1通過參與膽固醇代謝和加工淀粉樣蛋白前體蛋白質與LOAD的發(fā)病相關[5～7]。ABCA7的過度表達導致Aβ顯著減少[8]。因此，ABCA7通過改變ATP的轉運直接影響淀粉樣蛋白的病理學。雖然，ABCA7在LOAD的發(fā)病機制中起著關鍵作用，但在不同人群中存在差異，作為北方人群LOAD的危險因素ABCA7遺傳變異并不明確。此外,北方人群是中國代表性的人群，為了檢測受試者的遺傳風險關聯(lián),我們研究了ABCA7的6個SNPs,以評估這些SNPs與LOAD在ABCA7遺傳分析中的相關性。

1.研究對象與方法

1.1 研究對象 晚發(fā)性阿爾茨海默病患者是從北京醫(yī)院門診和門診部招募的。對照是經(jīng)過臨床排除有任何腦部疾患和精神癥狀的一般人群。年齡和性別結構如表1，兩組分布差異無統(tǒng)計學意義，P>0.05，具有可比性。

表1 LOAD患者和對照組特征的比較

1.2 入組標準 ①符合根據(jù)阿爾茨海默病協(xié)會的標準診斷的可能的阿爾茨海默病;②符合《精神疾病診斷和統(tǒng)計手冊》第四版(DSM IV)診斷輕度或中度阿爾茨海默病;③發(fā)病年齡為65歲或以上;④Hachinski缺血分級評分<4。

1.3 排除標準 如果患者符合以下任何標準,則排除:①目前或過去診斷有其他神經(jīng)系統(tǒng)疾病(如中風、帕金森病、外傷性腦損傷);②目前或過去診斷有精神疾病(如精神分裂癥、譫妄、主要抑郁障礙、幻覺、酒精或物質依賴性和/或誤用);③當前或過去診斷有代謝紊亂(如糖尿病、高血壓);④沒有可靠的照顧者能為神經(jīng)心理學和行為評估提供可靠的信息。

本項研究遵循《赫爾辛基宣言》的原則，獲得北京醫(yī)院倫理委員會批準。在參與研究之前,所有患者或監(jiān)護人均獲得書面的知情同意。

1.4 基因檢測 所有基因型都是用Sanger方法檢測。ABCA7和ApoE多態(tài)性站點的信息來自國家生物技術信息中心建立的單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫。

1.5 評價方法 簡易智力狀態(tài)檢查(MMSE,1993)和臨床癡呆評分表(CDR,1982)被用來評估患者的認知功能。

1.5.1 簡易智力狀態(tài)檢查：可能的總得分在MMSE范圍從0分(最嚴重)到30分(正常)。MMSE總分應考慮參加者的教育(如17為文盲,20為小學畢業(yè)生,24為中學畢業(yè)生或高等教育)。較高的MMSE評分表明阿爾茨海默病患者具有更好的認知功能。利用從基線到終點的MMSE總分的變化,確定患者認知能力下降的程度。

1.5.2 CDR評分分為5個點：CDR-0表明沒有認知障礙,其余4點表示LOAD的不同階段:CDR-0.5,非常輕度的LOAD;CDR-1,輕度LOAD;CDR-2,中度LOAD;CDR-3,重度LOAD。從基線到終點的CDR評分的增加用于確定患者認知障礙的進展。認知障礙的進展定義為增加一個點以上患者的總CDR評分。由兩名訓練有素的神經(jīng)科醫(yī)師通過訪談患者或其可靠的看護者,完成MMSE和CDR的評估。

1.6 統(tǒng)計學方法 利用基因型數(shù)據(jù)對ABCA7的6種基因多態(tài)性進行檢測，①基于χ2的哈德-溫伯格平衡(HWE)檢驗,用于檢測基因分型誤差;②SNPs病例對照研究采用卡方(χ2)試驗;③計算連鎖不平衡(LD’和r2)；④估算的單倍型塊；⑤以Haploview(http://www.broadinstitute.org/haploview/)推斷各單倍型塊并開展病例對照單倍型分析。為了評價這些遺傳變異和環(huán)境因素對LOAD發(fā)生風險的影響,進行了多元邏輯回歸分析。疾病的相對風險，OR值與95%的可信區(qū)間(CI)的計算以2×2列聯(lián)表。上述統(tǒng)計分析使用SPSS 22.0軟件。在SNPs的病例對照研究中，多元回歸分析顯示遺傳因素和環(huán)境因素對SNPs同時產(chǎn)生影響。計算SNPs與年齡、性別及ApoEε4等位基因的OR值及95%CI的關聯(lián)。當P<0.05時，差異具有統(tǒng)計學意義。

2.結果

2.1 研究對象的人群和臨床特點 300例LOAD患者和508例健康對照者參與了病例對照研究。HWE檢驗表明，ABCA7多態(tài)性的等位基因頻率分布無顯著偏離(rs3764650：P=0.43,rs2276412：P=0.83,rs3752246：P=0.43,rs74642146：P=0.91)，但rs115550680(P=0.004)和rs17125548(P=NA)顯著偏離。

2.2 LOAD患者中SNPs的基因型、等位基因頻率、遺傳模型及LOAD的風險分析 LOAD患者的6種ABCA7SNPs和對照組中的基因型和等位基因頻率，結果表明,兩組的等位基因分布有顯著差異rs3752246，P=0.01,OR(95%CI)=1.318(1.05-1.64)；rs3764650，P=0.002,OR(95%CI)=1.38(1.12-1.70)。此外,在LOAD患者中，rs3752246TT基因型樣本(P=0.04)和rs3764650T T基因型樣本(P=0.006)有顯著性關聯(lián)。

在病例對照組，rs3764650 T等位基因顯示有顯性效應[P=0.006,OR(95%CI)=1.75(1.17-2.62)],rs3764650TT基因型[P=0.02,OR(95%CI)=1.45(1.06-1.97)]對LOAD風險的調節(jié)也顯示有顯著效果。rs3752246的C等位基因[P=0.041,或(95%CI)=1.359(1.021-1.809)]病例對照組比較顯示有顯著性關聯(lián)。

2.3 LOAD與ApoEε4等位基因攜帶者、年齡和性別的相關性 對ApoEε4等位基因狀態(tài)的分層分析表明,在rs3764650的研究對象中不存在明顯的差異。在無ApoEε4等位基因的LOAD患者中，ABCA7 rs3764650 T等位基因出現(xiàn)較高頻率,與對照組比較OR=1.85,95%CI=(1.18-2.92),P=0.008。此外,年齡和性別分層分析進一步揭示,ABCA7 SNP rs3752246的“T”等位基因與LOAD風險顯著相關，尤其是rs3764650的“T”等位基因調節(jié)了男性患者與LOAD風險顯著相關[P=0.04；OR(95%CI)=1.87(1.03-3.43)]，并且rs3752246“T”等位基因與女性患者的LOAD風險極大的顯著相關[P=10-8,OR(95%CI)=19.81(7.60-51.62)]

2.4 LD結構和單倍型分析ABCA7 SNPs圖譜顯示，北方人群有2個LD基因區(qū)塊。一個LD塊由rs3752246和rs3764650組成,位于ABCA7的5’區(qū)域,另一個包括兩個SNPs(rs115550680和rs2276412)。單倍型分析分別在兩個LD塊中進行,我們的研究發(fā)現(xiàn)TC單倍型[P=1.29×10-7,或OR(95%CI)=15.138(3.996-57.341)]與增加LOAD風險相關。CC單倍型[P=5.99×10-6,OR(95%CI)=0.549(0.422-0.712)]在病例和對照組之間起到減少LOAD風險的作用。

3.討論

先前的研究結果顯示,ABCA7基因內的基因變異與中國人群的AD易感性有顯著的相關性。因為中國人群多樣性的特點，所以有必要利用ABCA7基因中的遺傳變異來識別特定中國地區(qū)人群的LOAD易感性。據(jù)我們所知,這是第一個評估ABCA7變異改變了北方人群的LOAD風險的研究。

這可能是由于在相關的SNPs標記的致病變異頻率上的人群差異(ABCA7 rs115550680在非西班牙裔白人是單一形態(tài);rs3752246的小等位基因在中國人群中是0.04，在非西班牙裔白人是0.19;rs3764650的小等位基因中國人群是0.25,非西班牙裔白人是0.11),或者是新確定的等位基因對疾病估計效果的偏倚。

然而,在ABCA7的影響大小上,白人和中國人在被診斷為LOAD的相對概率上存在有大的差異，也有可能是由對蛋白質的結構或功能有影響的種群特異性致病變異導致的。rs115550680位于多個內含子和外顯子之間的連鎖不平衡塊,這意味著rs115550680的變異可能導致的不平衡。因此,盡管這項研究的結果很好，仍需要在另外的獨立樣本人群中復制,并有足夠的力度可以檢測小概率事件并進行功能性確認,以前在白人和非洲裔美國人的研究中ABCA7是阿爾茨海默病的危險因子的結論[3,5]也支持我們的研究結果。

結果表明,在北方人群中ABCA7 rs3752246的等位基因和基因型分布與無ApoE ε4的LOAD和對照組的rs3764650多態(tài)性存在顯著差異。這表明,rs3752246和rs3764650的“T”等位基因可能是中國北方人群LOAD的危險因素。在ApoE ε4攜帶者、年齡和性別之間分別進行了分層分析,發(fā)現(xiàn)LOAD患者ApoE ε4非攜帶者在 rs3764650 和 rs3752246 之間的增加趨勢。在這個人群中,ABCA7可能優(yōu)于ApoEε4。三因素混合和年齡、性別的差異可導致結果偏倚。

我們研究發(fā)現(xiàn),有性別特異特征的LOAD患者與SNP rs3764650和rs3752246相關聯(lián)。我們檢測到rs3752246多態(tài)性是女性輕度認知功能障礙LOAD患者的關聯(lián)位點。在檢查LOAD患者的rs3764650，我們也發(fā)現(xiàn)該位點對男性的影響,這也支持以前的ABCA7是AD患者一個性別特定的遺傳危險因素。2017年歐洲人的研究表明,除了沒有證據(jù)顯示干擾ABCA7功能和攜帶ApoEε4等位基因之間的協(xié)同作用之外,還有獨立的性別因素，這也支持我們的研究。

可見,rs3764650的顯性和隱性模型均有明顯差異,rs3752246的基因型TT+CT在病例對照組中表現(xiàn)不顯著,但仍有趨勢具有顯性效應,推斷出未來的研究樣本量可以進一步擴大。

對于單倍型分析,我們識別到rs3764650和rs3752246與一個區(qū)塊的不平衡密切相關;即單倍型CC和TC,這與LOAD顯著相關。rs3764650位于基因的5’端,我們可以看到rs3752246是位于它旁邊并存在連鎖不平衡結構。rs3764650的基因多態(tài)性位于ABCA7基因的內含子區(qū)域,因此不影響氨基酸序列或蛋白質結構。但我們仍然可以推測,內含子突變可能會影響mRNA,改變內含子內的小分子,如增強子,然后影響轉錄。此外,rs3752246是ABCA7的同義變異。我們不能否認同義突變的作用,它可能影響轉錄因子結合的穩(wěn)定性,進而影響ABCA7的功能。這兩個變異聚集在ABCA7基因5’端可能影響ABCA7編碼蛋白的功能。

據(jù)我們所知，在北方人群中,沒有關于LOAD敏感性位點的數(shù)據(jù)。目前的研究有局限性，我們的病例對照研究規(guī)模較小,這可能影響了結果的穩(wěn)定性。病例對照組的年齡范圍和性別不匹配也是本研究的局限性。由于研究樣本的限制,rs3764650和rs3752246的意義與LOAD的關聯(lián)性估計是不足的,在大隊列研究中可以定量地比較。然而，我們的結果仍然提供了一些證據(jù)證明ABCA7與LOAD有關。此研究中我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了LOAD在特定的北方人群和ABCA7的關聯(lián)?？偟膩碚f，ABCA7遺傳變異(rs3752246和rs3764650)可以調節(jié)北方人群LOAD的風險,具有潛在的臨床應用價值。

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