高寶云，趙月梅

(商洛學(xué)院 生物醫(yī)藥與食品工程學(xué)院，陜西 商洛726000)

中藥辛夷來源于木蘭科植物望春花(Magnoliabiondii)、玉蘭(Magnoliadenudata)或武當(dāng)玉蘭(Magnoliasprengeri)的干燥花蕾[1]。辛夷原植物花蕾緊湊，鱗毛整齊，芳香濃郁。主產(chǎn)區(qū)為河南南召，分布于河南、陜西和貴州等地。其主要含揮發(fā)油，有丁香油酚、茴香油。具有辛散溫通、芳香走竄、上行頭面、善通鼻竅等功效[2]，藥用價值頗高。二喬玉蘭(Magnoliasoulangeana)為玉蘭與紫玉蘭的雜交種，落葉小喬木，下面具柔毛，花先于葉開放，果實(shí)同玉蘭。紫玉蘭(Magnolialiliiflora)為木蘭科木蘭屬常見植物，其花芳香淡雅，孤植或叢植都很美觀；花蕾被淡黃色絹毛，花葉同時開放。望春玉蘭(Magnoliabiondii)又名望春花、迎春樹、辛蘭，屬木蘭科木蘭屬多年生落葉喬木，花先于葉開放。黃山木蘭(Magnoliacylindrica)為落葉小喬木，花先于葉開放，中國特有種，零星分布于安徽、浙江、江西、福建，是國家三級保護(hù)植物[3]。景寧玉蘭(Magnoliasinostellata)為木蘭屬新種，聚合果成熟時通常為長圓狀圓柱形，常因心皮不育而偏斜彎曲。荷花玉蘭(Magnoliagrandiflora)的葉厚革質(zhì)，葉面深綠色，有光澤，花白色。

近年來，應(yīng)用中藥材防病治病的人越來越多，造成地道藥材嚴(yán)重緊缺，市場上供不應(yīng)求，部分藥材由于過分追求利潤出現(xiàn)了混偽品，以假亂真，嚴(yán)重地影響人民的用藥安全和身體健康[4]。目前有很多學(xué)者基于各種不同的方法對辛夷及其混偽藥材進(jìn)行了相關(guān)研究[5-7]，但傳統(tǒng)的中藥材鑒定方法，如形態(tài)、顯微結(jié)構(gòu)和化學(xué)指紋圖譜等，都有其自身不足。藥材性狀易受地理環(huán)境、生長期、貯存條件等因素的影響，從而影響鑒定的準(zhǔn)確性；化學(xué)分析法會因中藥活性成分的含量受到其生理?xiàng)l件、采收、貯藏等因素的影響；HPLC、CE、MS等化學(xué)儀器設(shè)備價格昂貴，一般實(shí)驗(yàn)室難以承擔(dān)。隨著近幾年中藥材DNA條形碼鑒定研究的不斷深入，中藥材鑒定也迎來一次新的技術(shù)革命。DNA條形碼技術(shù)是利用標(biāo)準(zhǔn)的、有足夠變異的、容易擴(kuò)增且相對比較短的DNA片段在種內(nèi)的特異性和種間多樣性而建立的一種新的識別系統(tǒng)，從而實(shí)現(xiàn)對物種的快速自動鑒定過程[8]。我國首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼序列，并建立了以ITS2為核心、psbA-trnH為補(bǔ)充序列的植物類藥材DNA條形碼鑒定體系，為中藥材的物種鑒定研究提供了方便又快捷的方法，可以在更大范圍應(yīng)用于生態(tài)保護(hù)和資源有效利用研究，擺脫了傳統(tǒng)形態(tài)鑒定方法依賴長期經(jīng)驗(yàn)的障礙，是中藥分子鑒定方法學(xué)上的一個創(chuàng)新[9]。

ITS序列是核糖體DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，即5.8S rDNA和28S rDNA基因間隔序列。它的長度與序列變化比較大，并且易于擴(kuò)增，具有進(jìn)化速度快和變異性高的特點(diǎn)，將其擴(kuò)增物進(jìn)行序列分析，可用于對種、屬進(jìn)行鑒別，甚至用于區(qū)分關(guān)系非常近的種。陳士林等[10]首次提出將ITS2序列作為藥用植物鑒定的通用條形碼。隨后，DNA條形碼分子鑒定方法在藥材鑒定方面得到快速發(fā)展以及應(yīng)用，山茱萸、羌活、秦艽、人參、枸杞、金銀花等研究驗(yàn)證了序列ITS2作為DNA條形碼鑒定藥材的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。車建等[11]應(yīng)用ITS序列對西紅花與其易混中藥材進(jìn)行了鑒定；高曉霞等[12]對廣佛手rDNA ITS序列進(jìn)行了分析，表明ITS序列可為鑒定佛手提供分子依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用玉蘭、望春玉蘭與其混偽品二喬玉蘭、紫玉蘭、黃山木蘭、景寧木蘭和荷花玉蘭，通過對樣本進(jìn)行基因組總DNA的提取，用ITS序列通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙向測序，并基于K2P模型進(jìn)行遺傳數(shù)據(jù)分析，建立了系統(tǒng)發(fā)生樹和條形碼評估系統(tǒng)。根據(jù)ITS序列差異特征，可準(zhǔn)確、有效地鑒別辛夷藥材及其混偽品，為木蘭科植物的形態(tài)變異及多樣性保護(hù)提供新分子水平的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

玉蘭、二喬木蘭、紫玉蘭、黃山木蘭均采自陜西省西安市西安植物園。采集過程中要注意選擇無病蟲害、長勢較好的完整新鮮葉片進(jìn)行隨機(jī)采集，將采集到的葉片擦洗干凈，直接存放到變色硅膠中，用塑料袋包扎好，常溫保存。玉蘭、景寧木蘭和荷花玉蘭植物的ITS序列均從Genbank網(wǎng)站下載。經(jīng)比對剪切后共21條序列。具體信息見表1。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測定

采用天根公司植物DNA 提取試劑盒(Tiangen Biotech Co., China)提取樣品總DNA。PCR引物為ITS通用引物：ITS5:GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG；ITS4: TCCTCCGCTTATTGATATGC。PCR反應(yīng)條件為：97 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增反應(yīng)采用20 μL的反應(yīng)體系：包括30～60 ng的模板DNA，2 μL 10× buffer，0.5單位的Taq DNA聚合酶(5 U/μL)，1.5 μL的MgCl2(25 mol/L)，1.5 μL的dNTPs (10 mmol/L)，正反向引物各2 μL(5 μmol/L)，再添加蒸餾水至20 μL。擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后，用華大基因有限公司的純化試劑盒純化并雙向測序。

表1 材料來源

1.3 數(shù)據(jù)分析

將獲得的DNA序列用Bioedit軟件進(jìn)行比對。用MEGA 5.0計算種間的遺傳距離和T、C、A、G的含量等，并基于K2P雙參數(shù)模型用NJ法1000次重復(fù)BOOTSTRAP檢驗(yàn)各分支的支持率，將比對過的序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以便直觀鑒定各物種。衡量DNA條形碼的一個重要的指標(biāo)是“barcode gap”是否存在，即序列的種間變異要足夠大，種內(nèi)變異要足夠小，從而在中間形成一個明顯的間隔區(qū)。本文用Meier等的TaxonDNA軟件結(jié)合一般的統(tǒng)計軟件構(gòu)建出能夠體現(xiàn)種間遺傳距離的分布頻度的柱形圖[13]。

2 結(jié)果與分析

2.1 種內(nèi)、種間序列比對分析

將辛夷等7種易混藥材的ITS序列比對后總長度為1514 bp，其中變異位點(diǎn)34個，占總位點(diǎn)的2.25%，所能提供的信息比較多。 分析表明T、C、A、G的平均含量分別為34.3%、18.8%、29.0%、17.9%。變異多發(fā)生在種間，如荷花玉蘭MagnoliagrandifloraKJ510880.1、MagnoliagrandifloraKF740420.1、MagnoliagrandifloraAM889723.1、MagnoliagrandifloraJX495733.1、MagnoliagrandifloraJN050023.1在67(T-G)、69(C-A)、374(T-C)等位點(diǎn)；景寧木蘭MagnoliasinostellataJN050071.1在374(T-C)、448(C-T)、533(G-A)、602(A-G)、721(A-G)、754(C-A)、762(A-C)等位點(diǎn)；望春玉蘭MagnoliabiondiiJN050031.1、MagnoliabiondiiJN050032.1在721(A-G)、754(C-T)、762(A-C)等位點(diǎn)；紫玉蘭Magnolialiliflora在490(C-T)、533(G-A)、623(G-A)、971(G-A)、979(G-A)、1008(T-G)等位點(diǎn)；二喬木蘭Magnoliasoulangeana在490(C-T)、533(G-A)、623(G-A)、979(G-A)等位點(diǎn)；黃山木蘭Magnoliacylindrica在490(C-T)、533(G-A)、762(A-C)、1008(T-G)等位點(diǎn)均出現(xiàn)了種間變異且較明顯。

2.2 辛夷及其混偽品的K2P遺傳距離分析

遺傳距離也是衡量種間及種內(nèi)關(guān)系的一個重要指標(biāo)，表2、圖1均顯示了ITS序列在辛夷藥材等近緣種種內(nèi)及種間的K2P距離分布。其中表2為種間、種內(nèi)距離分布，圖1為遺傳距離在種內(nèi)及種間的頻率分布圖。由表2可知：種間距離最大的是荷花玉蘭和紫玉蘭之間，為0.017。辛夷藥材的主要來源為玉蘭、望春玉蘭和武當(dāng)玉蘭，由于本文未采到武當(dāng)玉蘭的樣品，Genbank中也未搜索到武當(dāng)玉蘭的序列資源，因此本文僅針對前兩者進(jìn)行分析。遺傳距離顯示：雖然植物學(xué)上玉蘭與望春玉蘭為兩個獨(dú)立的物種，但兩者遺傳距離較小，僅為0.003(二喬玉蘭為玉蘭與紫玉蘭的雜交種，分類地位不考慮在內(nèi))，因此兩者親緣關(guān)系最近，化學(xué)成分相似，同作為辛夷藥材的基源植物。與辛夷遺傳距離最遠(yuǎn)的是荷花玉蘭，為0.017，表明兩者的分化時間最長，差異最大。

由圖1可知，在0.5%～1.0%頻率上出現(xiàn)了種間和種內(nèi)距離的累計頻率的重疊，表明該序列的種內(nèi)距離和種間距離重疊不多，在各個頻率上分布較明顯。

表2 辛夷等7種藥材的種間K2P距離統(tǒng)計(括號內(nèi)為種內(nèi)距離)

圖1 ITS片段種內(nèi)種間K2P距離頻率直方圖

2.3 聚類分析

雖然在K2P距離中種間種內(nèi)距離有少許重疊現(xiàn)象(0.5%～1.0%)，但由NJ法生成的聚類樹中(圖2)可以看出：7種植物藥材均能獨(dú)立聚為一支。荷花玉蘭的7個個體與其余幾個種親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，在聚類樹中分化出來最早；其余各種中景寧玉蘭僅次于荷花玉蘭，位于底端；剩余物種中，望春玉蘭較早分出，玉蘭和黃山木蘭組成了梳子狀結(jié)構(gòu)，表明兩者親緣關(guān)系較近；二喬玉蘭由于是雜交種，遺傳結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，因此部分個體和紫玉蘭聚在了一起，兩者區(qū)分度不高，但紫玉蘭個體自己能聚成一個單系。該聚類樹結(jié)果表明荷花玉蘭在木蘭屬植物中是最原始的物種，紫玉蘭是木蘭屬中最進(jìn)化的物種，作為辛夷藥材的望春玉蘭和玉蘭進(jìn)化地位居中。另外，黃山木蘭在遺傳上與玉蘭差別較小，極易混淆。

3 討論

本文分析了辛夷(玉蘭及望春玉蘭)及其近緣易混偽品二喬玉蘭、紫玉蘭和黃山木蘭等7種藥材基源植物的ITS序列，包括序列特征、K2P距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明：辛夷幾種藥材的ITS序列經(jīng)擴(kuò)增測序比對后得到1514 bp序列，變異位點(diǎn)占總位點(diǎn)的2.25%。荷花玉蘭和紫玉蘭遺傳距離最大，黃山木蘭和望春玉蘭，玉蘭和望春玉蘭之間的遺傳距離均最小。柱形圖結(jié)果在種內(nèi)種間區(qū)分明顯。NJ系統(tǒng)樹能將上述幾種藥材區(qū)分開，表明ITS序列可以作為辛夷及其偽品藥材鑒定的DNA條形碼。

bootstrap 1000次重復(fù)，枝上數(shù)值僅顯示自展支持率>50%。

從實(shí)驗(yàn)方法上來看，各樣品植物ITS序列的PCR反應(yīng)條件及通用引物應(yīng)用情況均表現(xiàn)良好，電泳條帶清晰，測序結(jié)果穩(wěn)定。表明該屬物種的ITS引物結(jié)合區(qū)間并未發(fā)生變異或有其他的特殊結(jié)構(gòu)，且在采樣不足的情況下，在Genbank中也有豐富的序列信息可供參考。從聚類結(jié)果可以看出，大部分物種均能各自聚成一個單系，且支持率較高，表明這些物種之間的遺傳距離是可以區(qū)分辛夷及其偽品之間的相互關(guān)系的。此外，玉蘭和望春玉蘭都作為辛夷的基源植物，兩者化學(xué)成分相似，遺傳距離較小，進(jìn)化時間較短，親緣關(guān)系比其他物種間的親緣關(guān)系要近得多。因此，兩者同作為辛夷的基源植物是有其遺傳基礎(chǔ)的。另外值得注意的是黃山木蘭與玉蘭的遺傳關(guān)系較近，一方面我們根據(jù)這個信息可以檢測黃山木蘭中是否含有與玉蘭和望春玉蘭等相似的化學(xué)成分，使得該植物可以作為辛夷的備選藥材，如果黃山木蘭中的化學(xué)成分與玉蘭和望春玉蘭等無相同或相似之處，則我們在以后的臨床用藥中應(yīng)特別注意該物種，避免與辛夷正品藥材相混淆。

本文除上述結(jié)果外依然存在些不足，如采集的樣品不夠豐富，同種藥材如玉蘭分布較廣，但本文只有一個樣品，導(dǎo)致遺傳信息不全。因此，在以后的研究中，如該藥材分布廣泛，應(yīng)擴(kuò)大其采樣范圍，保持其遺傳信息的完整。

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