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        Dot1l在正常豚鼠耳蝸中的表達(dá)

        2018-05-16 01:48:58章碧云秦麗羅小莉鐘時(shí)勛
        中華耳科學(xué)雜志 2018年2期
        關(guān)鍵詞:醛固酮豚鼠迷路

        章碧云 秦麗 羅小莉 鐘時(shí)勛

        重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院,耳鼻咽喉科(重慶400016)

        梅尼埃?。∕eniere’s disease,MD)是以眩暈、耳鳴、進(jìn)行性波動性聽力下降和耳脹滿感為表現(xiàn)的常見內(nèi)耳病,其病理基礎(chǔ)為膜迷路積水。內(nèi)淋巴液中高鉀低鈉的環(huán)境由Na+、K+轉(zhuǎn)運(yùn)維持,Na+、K+代謝失衡常導(dǎo)致內(nèi)淋巴水腫,從而導(dǎo)致膜迷路積水。

        上皮鈉通道(Epithelial Na+Channel,ENaC)作為高選擇性Na+通道,是Na+吸收的限速步驟,主要分布腎小管、結(jié)腸、分泌腺管道、呼吸道上皮。我們前期研究表明,ENaC在內(nèi)耳中也有表達(dá)[1],且參與內(nèi)淋巴水腫的形成[2]。近年通過對腎臟的研究表明,ENaC表達(dá)受組蛋白H3K79甲基化轉(zhuǎn)移酶Dot1l(Disruptor of telomeric silencing 1-like)的調(diào)控[3],然而內(nèi)耳是否也通過表達(dá)Dot1l、調(diào)控ENaC從而調(diào)節(jié)內(nèi)淋巴代謝仍不清楚。本實(shí)驗(yàn)期望通過研究Dot1l在內(nèi)耳中的表達(dá),為進(jìn)一步研究內(nèi)淋巴代謝、梅尼埃病發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

        1 材料和方法

        1.1 試劑

        兔抗鼠Dot1l單克隆抗體(Abcam,ab64077),SABC免疫組化試劑盒(博士德,SA1022),過氧化物酶阻斷劑(博士德,AR1108),DAB顯色液(博士德,AR1022)。

        1.2 實(shí)驗(yàn)動物的選擇和取材

        選取耳廓反射靈敏、聽性腦干反應(yīng)(ABR)檢測聽閾不超過30dB SPL的健康紅目豚鼠6只,體重200-300g,由重慶醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供,。豚鼠按40mg/kg 1%戊巴比妥鈉腹腔注射深度麻醉,予以生理鹽水心臟灌注至口唇蒼白后換為4%多聚甲醛繼續(xù)灌注,待頸僵直后迅速斷頭、游離顳骨取出耳蝸,同時(shí)取出腎組織。將耳蝸浸于4%多聚甲醛中,在手術(shù)顯微鏡下以精細(xì)鑷戳破圓窗膜,蝸頂鉆小孔后由蝸頂緩慢吹入液體,至圓窗流出液清亮后置入新的4%多聚甲醛液中固定48小時(shí),10%乙二胺四乙酸(EDTA)中脫鈣1月,期間隔天更換脫鈣液。將已脫鈣的耳蝸于各梯度酒精脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,以4um的厚度沿蝸軸切片。

        1.3 SABC法免疫組化

        65℃烤箱烤片2小時(shí),二甲苯脫蠟2小時(shí),梯度酒精(100%、95%、80%、75%)至水各1次,每次5分鐘,流水沖洗15分鐘。切片以內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑室溫孵育20分鐘,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次5分鐘,0.12%胰酶37℃孵育30分鐘,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗3次,每次5分鐘,BSA 37℃孵育20分鐘,甩去血清,加入滴度為1:100的兔抗小鼠Dot1l抗體,4℃過夜后37℃復(fù)溫1小時(shí),PBS洗3次,每次5分鐘,SABC室溫孵育20分鐘,PBS洗3次,每次5分鐘,山羊抗兔二抗37℃30分鐘,PBS洗3次,每次5分鐘。DAB顯色后蘇木素復(fù)染90秒,鹽酸分化2秒,飽和碳酸鋰返藍(lán)2分鐘,脫水,封片。腎臟做陽性對照,PBS代替Dot1l抗體做空白對照。鏡下組織出現(xiàn)黃色或棕色顆粒為陽性。采用Image-Pro Plus 6.0計(jì)算三轉(zhuǎn)免疫組化陽性各部位平均光密度值(OD值)。

        1.4 統(tǒng)計(jì)分析

        所有數(shù)據(jù)以SPSS 20.0軟件處理,資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(± s)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述。三轉(zhuǎn)間的光密度(optical density,OD)值比較采用單因素方差分析,以P<0.05為有差異,Graphpad Prism 6.0作圖。

        2 結(jié)果

        2.1 ABR豚鼠聽閾19.58±4.50dB SPL,符合實(shí)驗(yàn)動物要求。

        2.2 免疫組化

        以Dot1l在腎臟的表達(dá)作為陽性對照,Dot1l主要表達(dá)于腎小管細(xì)胞質(zhì)(圖1)。以生理鹽水代替Dot1l一抗作為實(shí)驗(yàn)的陰性對照,見耳蝸各部位無顯色(圖2)。Dot1l在豚鼠耳蝸中廣泛表達(dá)于血管紋(stria vascularis,StV)、螺旋韌帶(spiral ligament,SPL)、前庭膜(Reissner’s membrane,RM)、Corti器(organ of Corti,OC)、螺旋緣(spiral limbus,SLM)(圖3、圖4),螺旋神經(jīng)節(jié)(spiral ganglion,SG)(圖5)、外螺旋溝根細(xì)胞(Root Cell,RC)(圖6)。Dot1l在螺旋神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)逐漸增強(qiáng)(圖5、圖7),OD值分別為0.100±0.019、0.121±0.008、0.149±0.0060,F(xiàn)=6.22,P=0.0201;在螺旋韌帶中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)向中轉(zhuǎn)、頂轉(zhuǎn)逐漸減少(圖4、圖7),OD值分別為0.151±0.006、0.121±0.006、0.106±0.023,F(xiàn)=8.29,P=0.0091。Dot1l在各轉(zhuǎn)血管紋、前庭膜、Corti器、螺旋緣中的表達(dá)無顯著差異。因部分標(biāo)本切片時(shí)根細(xì)胞處破損,三轉(zhuǎn)根細(xì)胞未能做灰度值統(tǒng)計(jì)分析。

        圖1 Dot1l在豚鼠腎臟遠(yuǎn)端集合小管的表達(dá)。Fig.1 Dot1l expresses in renal collecting duct cells as positive control.圖2 以生理鹽水代替Dot1l抗體作為陰性對照,免疫組化無陽性顯色。Fig.2 No positive area was detected when anti-Dot1l was replaced by saline.圖3 Dot1l在豚鼠耳蝸各轉(zhuǎn)螺旋器、螺旋神經(jīng)節(jié)中均有表達(dá)。Fig.3 Dot1l was found in in spiral organ and spiral ganglion in allturns.圖4 Dot1l表達(dá)于血管紋(StV)、螺旋韌帶(SPL)、前庭膜(RM)、Corti器(OC)、螺旋緣(SLM),在螺旋韌帶中由底轉(zhuǎn)(4a)向中轉(zhuǎn)(4b)、頂轉(zhuǎn)(4c)表達(dá)逐漸降低、分布逐漸集中于近血管紋側(cè)。Fig.4 Dot1l exists in the stria vascularis(StV),Reissner’s membrane(RM),spiral ligament(SPL),organ of Corti(OC),spiral limbus(SLM)and spiral ganglion.From basal turn to apical turn,Dot1l expression in spiral ligament decreased.圖5 Dot1l在螺旋神經(jīng)節(jié)中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)(5a)向中轉(zhuǎn)(5b)、頂轉(zhuǎn)(5c)增強(qiáng)。Fig.5 Dot1l expression in spiral ganglion increased from basal turn to apical turn.圖6 Dot1l在根細(xì)胞(RC)處呈現(xiàn)強(qiáng)陽性表達(dá)。Fig.6 Dot1l has a strong expression root cell(RC).

        3 討論

        Na+、K+離子代謝紊亂是導(dǎo)致膜迷路積水的基礎(chǔ)。1997年Dunnebier首次通過手術(shù)破壞單側(cè)內(nèi)淋巴囊或內(nèi)淋巴管后全身應(yīng)用醛固酮,未手術(shù)側(cè)仍出現(xiàn)膜迷路積水[4],隨后蔣子棟[5,6]通過單純腹腔注射醛固酮也成功誘導(dǎo)出膜迷路積水,推測醛固酮可能通過調(diào)節(jié)水鈉平衡引起膜迷路積水。Zhang等通過對腎臟的研究表明,醛固酮抑制Dot1l的可變剪切體Dot1a與Af9的作用[7,8]解除Dot1a-Af9對α-ENaC啟動子區(qū)組蛋白H3K79的甲基化,增強(qiáng)α-ENaC表達(dá),從而調(diào)節(jié)水鈉代謝[3]。我們前期研究證實(shí)ENaC在豚鼠耳蝸中表達(dá)于血管紋、螺旋韌帶、前庭膜、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、螺旋緣等部位[1],且ENaC也參與內(nèi)淋巴積水的形成[2],醛固酮作用后AF9蛋白在豚鼠耳蝸中表達(dá)減弱[9]本次研究表明Dot1l表達(dá)于豚鼠耳蝸的血管紋、螺旋韌帶、前庭膜、螺旋神經(jīng)節(jié)、Corti器、螺旋緣等ENaC表達(dá)的部位,因此我們推測可能與腎臟類似,ENaC在豚鼠耳蝸中對內(nèi)淋巴循環(huán)的調(diào)控也與Dot1l-Af9的表達(dá)有關(guān)。

        Ten Cate WJ等認(rèn)為,Na+,K+-ATP酶在血管紋的活性由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)增加[10],蔣子棟等認(rèn)為其可能與醛固酮引起膜迷路積水的發(fā)生機(jī)制有關(guān)[4]。離子通道的轉(zhuǎn)運(yùn)能力除與活性相關(guān)以外,還與表達(dá)量和分布有關(guān),我們研究發(fā)現(xiàn),Dot1l在螺旋韌帶中的表達(dá)由底轉(zhuǎn)(圖4c)向中轉(zhuǎn)(圖4b)、頂轉(zhuǎn)(圖4a)逐漸降低,且表達(dá)逐漸集中于靠近血管紋側(cè)。由于醛固酮可通過抑制Dot1l來增強(qiáng)ENaC的表達(dá)[6,7],因此我們推測Dot1l在各轉(zhuǎn)螺旋韌帶中的表達(dá)差異可能導(dǎo)致ENaC的表達(dá)或活性由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)逐漸增強(qiáng),從而使各轉(zhuǎn)的內(nèi)淋巴代謝能力不同,但還需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。

        梅尼埃病患者有逐漸加重的波動性聽力下降,耳蝸電圖多有異常,既往觀點(diǎn)認(rèn)為其聽力下降是內(nèi)淋巴液生化代謝紊亂使毛細(xì)胞、傳入神經(jīng)纖維、螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞發(fā)生退行性變導(dǎo)致,但無法解釋聽力損失呈早期低頻型、晚期平坦型的頻率特點(diǎn)。Zhang W[7]等證實(shí)醛固酮可下調(diào)Dot1l表達(dá),劉抗寒等通過對腎臟的研究表明下調(diào)Dot1l-AF9表達(dá)可增加 ET-1 的表達(dá)[12,13]。ET-1可促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放,增加Ca2+受體的敏感性,造成細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載從而損傷細(xì)胞,在感音神經(jīng)性耳聾的發(fā)生上有一定作用[11][14,15]。我們推測:醛固酮作用后螺旋神經(jīng)節(jié)Dot1l表達(dá)減弱、ET-1表達(dá)增強(qiáng),引起血管收縮、鈣超載等損傷螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞,從而影響聽力。Dot1l在頂轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)(圖5c)中的表達(dá)強(qiáng)于中轉(zhuǎn)(圖5b)、底轉(zhuǎn)(圖5a),因此我們進(jìn)一步推測:醛固酮在頂轉(zhuǎn)螺旋神經(jīng)節(jié)下調(diào)Dot1l表達(dá)的作用可能比在中轉(zhuǎn)、底轉(zhuǎn)更明顯,使得頂轉(zhuǎn)的ET-1表達(dá)增加進(jìn)而損傷螺旋神經(jīng)節(jié)的效應(yīng)作用更強(qiáng),因而低頻聽力更易受到損害。然而梅尼埃病患者及膜迷路積水動物模型內(nèi)耳中是否確有ET-1表達(dá)的增加,仍待進(jìn)一步研究證實(shí)。

        本研究顯示,Dot1l在外螺旋溝的根細(xì)胞呈強(qiáng)陽性表達(dá)(圖6)。根細(xì)胞是位于Claudius細(xì)胞深層的根狀細(xì)胞,是外螺旋溝從內(nèi)淋巴液中重吸收Na+、分泌K+、維持內(nèi)淋巴液低鈉高鉀的重要部位16-18]Dot1l在根細(xì)胞的強(qiáng)陽性表達(dá)可能對維持根細(xì)胞的正常內(nèi)淋巴液代謝有重要作用。根細(xì)胞在耳蝸各轉(zhuǎn)的形態(tài)、數(shù)量有差異[16],這也可能導(dǎo)致各轉(zhuǎn)耳蝸的離子代謝能力不同。

        圖7 Dot1l在耳蝸各部位的表達(dá)相對定量分析。在螺旋韌帶中,Dot1l由底轉(zhuǎn)向頂轉(zhuǎn)減弱(F=8.29,P=0.0091),在螺旋神經(jīng)節(jié)中由底轉(zhuǎn)向底轉(zhuǎn)增強(qiáng)(F=6.22,P=0.0201)。*P<0.05。**P<0.01。Fig.7 The relative analysis of Dot1l expression in each position.From basal turn to apical turn,Dot1l expression in spiral ligament decreased(F=8.29,P=0.0091),while that in spiral ganglion increased(F=6.22,P=0.0201).*P<0.05.**P<0.01.

        本實(shí)驗(yàn)首次研究了Dot1l在豚鼠耳蝸中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)Dot1l表達(dá)于豚鼠耳蝸中Na+代謝的關(guān)鍵部位,結(jié)合我們前期對Af9的研究[8],我們推測Dot1l-Af9可能參與維持內(nèi)淋巴循環(huán)。

        參考文獻(xiàn)

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