宋青玲曲騰飛張偉于樹夔何志洲,2龔樹生

1首都醫(yī)科大學附屬友誼醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（北京100050）2 Creighton大學醫(yī)學院生物醫(yī)學研究所（美國 奧馬哈NE68178）

遺傳性耳聾目前是導致新生兒出生缺陷的主要疾病之一，目前已有大約1/3的遺傳性耳聾致病基因得到驗證，但仍有大約300個疑似致病基因有待進一步發(fā)現(xiàn)與確認[1]。我們在前期的研究工作中，通過Microarray基因芯片技術分別對小鼠耳蝸內(nèi)毛細胞與外毛細胞中可能發(fā)揮重要作用的基因的RNA水平進行檢測，數(shù)據(jù)分析后發(fā)現(xiàn)：c-Maf蛋白為表達于耳蝸內(nèi)外毛細胞中的、在二者轉(zhuǎn)錄水平均有較高表達（表達量均為8.0左右）的轉(zhuǎn)錄因子。據(jù)此我們推測：c-Maf基因的突變有可能會導致嚴重的遺傳性耳聾[2]。

c-Maf蛋白是Maf轉(zhuǎn)錄因子家族大Maf家族成員之一，其基因片段位于人類第16號染色體長臂23.2位點（16q23.2），共包含27個外顯子。c-Maf蛋白的結(jié)構(gòu)域從N端到C端分別為：酸性轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域，組氨酸/甘氨酸重復結(jié)構(gòu)域，擴展同源區(qū)以及堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域[3,4]。c-Maf及其家族成員最具特征性的結(jié)構(gòu)為位于C端的亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)域，其在進化上高度保守，能夠單獨作用或與細胞核內(nèi)其他含有b-Zip結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合形成同源二聚體，與DNA上的Maf識別元件以及富含5-AT的Maf半識別元件的結(jié)合，從而調(diào)控相關基因的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)細胞功能與生長發(fā)育[5]。

目前研究顯示，c-Maf蛋白在生物體生長發(fā)育的過程中對細胞分化與組織器官的形態(tài)形成均發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，其在肝臟[6]、腎臟[6]、眼晶狀體[7]、T細胞[8]和感覺神經(jīng)系統(tǒng)[9,10]中廣泛表達且均起到了調(diào)控發(fā)育與功能維持的關鍵作用，但是其在聽神經(jīng)科學中的表達與功能的研究尚屬于空白。在外周感覺神經(jīng)系統(tǒng)中，c-Maf是一個關鍵的、能夠?qū)ｉT調(diào)控皮膚機械感受器（特別是高頻感受器）的發(fā)育和功能的轉(zhuǎn)錄因子，同時，結(jié)合c-Maf在內(nèi)外毛細胞轉(zhuǎn)錄組的高表達水平，我們推測，c-Maf可能在毛細胞機械感受的過程中同樣也會發(fā)揮重要的作用。因此，我們擬針對c-Maf基因在耳蝸內(nèi)外毛細胞的表達部位以及時間相關性進行更加深入的研究。

本研究中，我們首先分析了Microarray基因芯片的檢測數(shù)據(jù)，對內(nèi)、外毛細胞中c-Maf基因的轉(zhuǎn)錄水平進行分析、比較；隨后，通過c-Maf蛋白免疫熒光染色、全耳蝸標記、鋪片，我們確定了c-Maf基因在耳蝸內(nèi)外毛細胞的表達部位，并通過對毛細胞特定區(qū)域的熒光強度分析，對成年小鼠內(nèi)耳毛細胞中c-Maf在不同部位的表達強度進行初步分析。另外，我們對其在各發(fā)育時期（P0，P7，P12）的表達與定位進行了染色分析，觀察c-Maf蛋白表達與耳蝸發(fā)育時間的相關性，為進一步深入研究其在耳蝸內(nèi)、外毛細胞發(fā)育中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級6周齡成年C57BL/6J小鼠3只，P0,P7,P12乳鼠各2只（維通利華，實驗動物合格證編號：生產(chǎn)許可SCXK（京）2016-0006）。

1.1.2 實驗試劑

兔源c-Maf抗體（美國proteintech公司，55013-1-AP）；Alexa Fluorence羊抗鼠抗體（美國Life公司，A-11034）；免洗 DAPI（4',6-Diamidino-2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染液（中杉金橋，ZLI-9557）。

1.2 方法

1.2.1 耳蝸基底膜制備

小鼠深度麻醉后頸椎離斷，用剪刀斷頭后取出雙側(cè)顳骨，解剖顯微鏡下用鑷子迅速清除多余的軟組織，并用1ml注射器針頭蝸尖打孔，并捅破圓窗和卵圓窗，用10%甲醛蝸尖灌流，并置于4℃固定過夜12h。放入10%EDTA溶液中脫鈣12h-18h，之后于解剖顯微鏡下從頂回向底回剝除蝸殼，切除螺旋韌帶，并清除前庭膜及蓋膜。取出基底膜放于EP管中待染色。

1.2.2 免疫熒光染色

將分離好的基底膜置于0.3%Triton X-100中30 min后，10%山羊血清封閉1h；換用一抗：兔源性c-Maf抗體（1:50）4℃過夜，PBS沖洗3次，15min/次；加二抗，37℃孵育1h，PBS沖洗3次，15min/次。DAPI染色：載玻片上滴加一滴免洗DAPI封片液，解剖顯微鏡下鋪片后，將蓋玻片倒扣于載玻片上。1.2.3激光共聚焦顯微鏡成像

激光共聚焦顯微鏡：使用63倍油鏡，顯微鏡型號（TCS SP5 II;Leica Microsystems,Wetzlar,Germany）。于顯微鏡下選擇目標區(qū)域，選擇激發(fā)光波長分別為358nm和488nm，對此區(qū)域設定層掃的距離及層厚，從上到下依次掃描，層厚0.35μm/層，最后對圖片進行疊加，所獲取的最終圖像在軟件Photoshop CS5進行后處理。

1.2.4 免疫熒光強度統(tǒng)計

使用軟件Image Pro Plus（IPP）測量熒光強度：①采集圖片：控制需要測量熒光強度的圖片為同一批標本且為在同一條件下制作，共聚焦顯微鏡拍照過程中采用統(tǒng)一強度的激發(fā)光，按照需求采集圖片。②計算熒光強度：選定需要計算熒光強度的圖片，點擊Invert contrast對圖片進行黑白反相處理，應用此處理后即可測量熒光強度。首先，測量圖片背景強度，設置背景強度為基礎值，之后選定目標區(qū)域，測量此處熒光強度并與背景強度進行對比，從而計算出此區(qū)域的熒光強度（IOD值），軟件同時會計算出此區(qū)域的面積（area），依次對每一幅圖的目標區(qū)域進行測量。最后計算單位面積的熒光強度：單位面積熒光強度=所選區(qū)域總熒光強度/區(qū)域面積（OD=IOD/area），采用統(tǒng)計學軟件對數(shù)據(jù)進行分析整理。

1.2.5 Microarray基因芯片技術

采用微管吸引技術在顯微鏡下采集6周齡大小CBA/J小鼠的2000個內(nèi)毛細胞與2000個外毛細胞，分別提取其總RNA（約3-5ng），經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA后經(jīng)體外擴增合成新的RNA后熒光分子標記，分別分成3組后與2.0基因芯片（GeneChip Mouse Gene 2.0 ST Arrays）進行雜交，待芯片完全干燥后，利用掃描儀進行掃描，掃描后將圖像轉(zhuǎn)化為基于熒光強度的數(shù)字信號。在芯片實驗中，由于影響實驗結(jié)果的因素較多，無法將幾個芯片實驗結(jié)果進行直接比較，故將每組芯片數(shù)據(jù)進行歸一化處理，對兩組樣品的檢測信號與標準信號進行回歸分析并由此得到相對于標準信號的基因表達數(shù)值，結(jié)果均為相對值（此項工作于美國Creighton大學聽覺研究中心完成），最后對結(jié)果進行統(tǒng)計分析。c-Maf基因的轉(zhuǎn)錄水平為其中的一組數(shù)據(jù)。

1.2.6 SPSS統(tǒng)計軟件，主要統(tǒng)計方法為Student’s t檢驗。P＜0.05時有統(tǒng)計學意義。

圖1 單獨采集成年小鼠2000個耳蝸內(nèi)毛細胞與2000個外毛細胞，分別提取細胞內(nèi)的RNA進行Microarray基因芯片檢測(每種分為三組)，其中內(nèi)毛細胞與外毛細胞中的c-Maf表達量相近，均為8左右，表達水平較高。Fig.1 2000 inner hair cells and 2000 outer hair cells from adult mice cochlear were collected individually,and the RNA of two cells was extracted from each of the two cells.GeneChip microarray was used to detect the expression of total RNAs.The expression of c-Maf in inner hair cells and outer hair cells was close to 8,indicating a high level of expression.

2 結(jié)果

首先，我們根據(jù)Microarray基因芯片技術對2000個內(nèi)毛細胞與2000個外毛細胞中小鼠各基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的RNA的量進行分析，發(fā)現(xiàn)c-Maf在內(nèi)外毛細胞中均有較高表達：內(nèi)毛細胞中的表達量為8.12±0.05，外毛細胞中的表達量為8.15±5.35，其在內(nèi)外毛細胞的轉(zhuǎn)錄水平相近，無明顯差別（P＞0.05）（圖1）。

在此基礎上，我們開展了c-Maf蛋白在內(nèi)耳毛細胞中的表達的研究，成年C57BL/6J小鼠耳蝸基底膜鋪片可見：c-Maf蛋白信號分布于成年小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞胞質(zhì)中（圖2，圖3，圖4），經(jīng)熒光度值計算后發(fā)現(xiàn)：c-Maf的熒光信號在內(nèi)毛細胞的核下區(qū)強于核上區(qū)（圖2）；其在外毛細胞中的熒光強度與內(nèi)毛細胞相差并不大，無統(tǒng)計學差異（圖3）。

在小鼠出生后各時間點（P0，P7，P12）的耳蝸基底膜鋪片中可以觀察到：c-Maf蛋白從P0開始即表達耳蝸于內(nèi)外毛細胞胞質(zhì)中，并在P7、P12持續(xù)表達，各時間點中c-Maf蛋白隨著內(nèi)外毛細胞形態(tài)的生長變化持續(xù)分布于細胞質(zhì)中（圖5）。

圖2 c-Maf在內(nèi)毛細胞的表達情況，由圖可知：c-Maf表達于內(nèi)毛細胞胞質(zhì)，在細胞核上區(qū)域與核下區(qū)域均有表達，經(jīng)熒光強度分析可見：核下區(qū)熒光強度強于核上區(qū)（核下區(qū)2.298±0.694，核上區(qū)0.643±0.372），有統(tǒng)計學意義P＜0.05。Fig.2 The expression of c-Maf in the inner hair cells:c-Maf was expressed in the cytoplasm of inner hair cells,and it was distributed in both supernuclear region and the subnuclear region.By fluorescence intensity analysis,the fluorescence intensity in the subnuclear region 2.298 ± 0.694 was stronger than that in the supernuclear region 0.643±0.372,which was statistically significant,P＜0.05.

3 討論

感音神經(jīng)性聾是最常見的感覺障礙，全球大約有3億人受感音神經(jīng)性聾的困擾。感音神經(jīng)性聾的原因很多，內(nèi)耳感覺細胞或者神經(jīng)元的損傷最重要的原因，其中包括：環(huán)境因素（感染，耳毒性藥物，以及噪音暴露等）、年齡因素及遺傳因素等。由于成年哺乳動物的內(nèi)耳缺乏自我修復的能力，所以毛細胞的損傷是永久、不可逆轉(zhuǎn)的[11]。目前，除了獲得性聽力損失，已經(jīng)有超過300個基因位點可能與聽力損失相關，其中70多個致病基因已經(jīng)被證明可導致遺傳性聾[1]。此外，約80%的遺傳性耳聾是隱性遺傳，其余為顯性遺傳[1]。遺傳性聾的致病基因研究及基因治療均是目前耳神經(jīng)科學領域的研究熱點[12]。

c-Maf基因在全身各器官廣泛表達，并在多種器官的形態(tài)發(fā)育與功能維持中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，為重要的轉(zhuǎn)錄因子。Hagen Wende等在外周神經(jīng)系統(tǒng)研究中發(fā)現(xiàn)，攜帶顯性c-Maf基因突變的人類對對高頻震動的感受功能存在一定程度的減退，相應地，c-Maf基因敲除小鼠的多種皮膚快適應感受器的發(fā)育和功能均受損——觸覺產(chǎn)生過程中對壓力刺激的反應能力下降、時限變長。因此，c-Maf是一個能夠調(diào)控皮膚觸覺感受器的發(fā)育和功能的關鍵的轉(zhuǎn)錄因子。聽神經(jīng)系統(tǒng)同樣作為外周神經(jīng)系統(tǒng)的的一部分，聽神經(jīng)電信號的產(chǎn)生依賴于內(nèi)毛細胞纖毛感受機械振動，并通過突觸與神經(jīng)向中樞傳遞，從而產(chǎn)生聽覺。毛細胞的機械感受功能與皮膚機械感受功能存在一定的相似性，且c-Maf在耳蝸內(nèi)外毛細胞中均存在較高的轉(zhuǎn)錄水平，因此，c-Maf基因在耳蝸內(nèi)外毛細胞中的表達與功能成為了我們的研究對象。

圖3 c-Maf在三排外毛細胞的表達情況，由圖可知：c-Maf表達于耳蝸三排外毛細胞胞質(zhì)，其熒光強度與內(nèi)毛細胞相近（外毛細胞的熒光強度為2.626±0.435，內(nèi)毛細胞熒光強度為2.162±0.647），無統(tǒng)計學意義P＞0.05.Fig.3 The expression of c-Maf in the outer of the hair cells is illustrated:c-Maf is expressed in the cytoplasm of outer hair cells of the cochlea,and its fluorescence intensity（2.626±0.435）is similar to the inner hair cells（2.162±0.647）,with no statistical significance.P＞0.05.

圖4 耳蝸基底膜內(nèi)外毛細胞側(cè)面掃描圖，c-Maf表達于內(nèi)毛細胞與外毛細胞的胞質(zhì)Fig.4 The lateral map of the inner and outer hair cells of the cochlear basement membrane.c-Maf is expressed in the cytoplasm of the inner hair cells and the outer hair cells.

圖5 c-Maf蛋白在小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞各個時間點（P0，P7，P12）的表達情況，局部放大的圖片顯示：在P0，P7，P12這三個時間點，c-Maf均穩(wěn)定表達于內(nèi)毛細胞與外毛細胞的胞質(zhì)。Fig.5 The expression of c-Maf of different stages(P0，P7，P12)in inner and outer hair cells.c-Maf protein was stably expressed in the inner and outer hair cells of the cochlea 0,7 and 12 days after the birth of the mice.

本研究結(jié)果顯示，c-Maf基因在成年C57BL/6J小鼠耳蝸內(nèi)外毛細胞中均有較高的轉(zhuǎn)錄，且二者轉(zhuǎn)錄水平相近。c-Maf蛋白在耳蝸內(nèi)外毛細胞胞質(zhì)內(nèi)均有較強的表達，通過對內(nèi)毛細胞與外毛細胞各區(qū)域免疫熒光強度分析比較，可發(fā)現(xiàn)二者強度相近，此結(jié)果與Microarray基因芯片測量數(shù)據(jù)一致。另外，通過單獨對內(nèi)毛細胞不同區(qū)域的熒光強度進行分析后發(fā)現(xiàn)：將內(nèi)毛細胞按照細胞核上區(qū)域與細胞核下區(qū)域進行劃分后，分別統(tǒng)計兩區(qū)域蛋白信號的熒光強度，我們發(fā)現(xiàn)核下區(qū)的熒光明顯強于核下區(qū)，表明此蛋白在內(nèi)毛細胞核下區(qū)較核上區(qū)富集。c-Maf蛋白在內(nèi)毛細胞的這種分布情況可能與蛋白的功能密切相關，例如c-Maf的表達可能與內(nèi)毛細胞的囊泡轉(zhuǎn)運[13]、突觸功能[14-16]、內(nèi)毛細胞底部離子通道或核下區(qū)的細胞器等功能的維持與調(diào)節(jié)相關。但是，在我們研究中，目前僅對c-Maf在耳蝸內(nèi)外毛細胞中的表達較明確，其在螺旋神經(jīng)節(jié)、耳蝸核及聽皮層的表達尚不清楚，需要進一步深入的研究，以明確其在整個聽神經(jīng)系統(tǒng)的表達與分布。另外，本實驗通過對耳蝸各發(fā)育時間點（P0，P7，P12）的染色鋪片發(fā)現(xiàn)：c-Maf蛋白在C57小鼠在出生時的內(nèi)、外毛細胞上即有較明顯的表達，分布于毛細胞的胞質(zhì)，隨著小鼠的年齡增大，在耳蝸的發(fā)育中該信號在內(nèi)、外毛細胞胞質(zhì)中持續(xù)存在，c-Maf可能對耳蝸毛細胞的發(fā)育起調(diào)控作用。Brian等在研究c-Maf蛋白對小鼠視覺系統(tǒng)發(fā)育的影響中發(fā)現(xiàn)：c-Maf基因敲除的小鼠胚胎期晶狀體發(fā)育畸形，初級和次級視神經(jīng)元細胞軸突不延長，此蛋白在視覺系統(tǒng)的發(fā)育中非常關鍵[17]。那在聽覺系統(tǒng)的發(fā)育中c-Maf是否也發(fā)揮著重要作用呢？由于目前已知的c-Maf全基因片段敲除小鼠的純合子為胚胎致死性，因此，實驗中需要制作條件性c-Maf基因敲除小鼠，或者可以采用將攜帶能夠干擾c-Maf表達的質(zhì)粒的病毒導入內(nèi)耳[18]，在小鼠的不同發(fā)育階段進行基因敲除或病毒干擾，比較小鼠的耳蝸形態(tài)及聽覺功能的變化。

綜上所述，我們首次對c-Maf基因在小鼠耳蝸內(nèi)、外毛細胞中的表達、分布特點進行觀察，發(fā)現(xiàn)c-Maf蛋白在耳蝸內(nèi)、外毛細胞中均有較高表達，且在這兩種細胞中表達量相近，其在內(nèi)毛細胞核下區(qū)的分布明顯強于核上區(qū)，此分布情況可能與蛋白的功能相關。在小鼠耳蝸的發(fā)育過程中，c-Maf蛋白穩(wěn)定地表達于內(nèi)、外毛細胞中，可能在毛細胞的發(fā)育中起調(diào)控作用。有關該基因在聽覺系統(tǒng)中所發(fā)揮的的作用有待于進一步研究來證實。

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