巫靜帆李小霞譚淑娟付有晴楊茜朱鵬遠馬秋林周光紀劉彥慧

1廣東醫(yī)科大學醫(yī)學檢驗系（東莞523000）2廣東省東莞市婦幼保健院產(chǎn)科（東莞523000）3廣東省東莞市婦幼保健院耳鼻喉科（東莞523000）4廣東省東莞市婦幼保健院產(chǎn)前診斷中心（東莞523000）5東莞市博奧木華基因科技有限公司（東莞523808）

先天性聽力障礙是常見的出生缺陷之一。中國第二次殘疾人抽樣調查數(shù)據(jù)顯示，聽力及言語殘疾人高達2780萬，7歲以下聾兒約80萬，且以年均3萬的速度增長[1]，加上遲發(fā)性和藥物性耳聾，每年將新增6-8萬耳聾患者[2]。導致聽力障礙的因素包括遺傳、環(huán)境及兩者共同作用三大類，遺傳性耳聾包含最常見的3個基因，分別為GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA，但不同地區(qū)突變熱點存在差異。突變位點的差異對制定有效的預防、干預措施具有指導意義。本研究采用遺傳性耳聾基因芯片檢測技術對東莞戶籍新生兒耳聾基因進行了檢測，并對部分樣本聯(lián)合聽力篩查進行了檢測與分析，現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象

2016年1月至2017年2月期間，在東莞地區(qū)40家醫(yī)院出生的新生兒，這些新生兒的父母至少有一方是東莞戶籍。

1.2 聽力篩查方法

新生兒于出生2-3天后采用耳聲發(fā)射法(otoacoustic emission,OAE)進行初次聽力篩查，初篩不通過者在出生后29-42天進行復篩，復篩采用OAE與自動判別聽性腦干誘發(fā)電位法(auto auditory brainstem response,AABR)結合檢測。復篩未通過者，于3月齡進行聽力診斷。

1.3 耳聾基因檢測方法

新生兒出生1-3天內采集足跟血2-5滴，血斑直徑8mm，制成干血片。參照干血斑基因組DNA提取標準操作規(guī)程提取基因組DNA，應用晶芯?九項遺傳性耳聾基因檢測試劑盒（微陣列芯片法）對4個耳聾基因的9個位點進行檢測，包括GJB2（c.235delC， c.299_300delAT， c.176_191del16，c.35delG）、SLC26A4（IVS7-2A＞G，c.2168A＞G）、線粒 體 12SrRNA（m.1555A＞G，m.1494C＞T）和 GJB3（c.538C＞T）。儀器為PCR擴增儀（博日TC-96/G/H(b)）、晶芯?SlideWasherTM芯片洗干儀、HybSet基因微陣列芯片雜交盒、晶芯?LuxScanTM10K/B微陣列芯片掃描儀。試劑與儀器均由博奧生物集團有限公司提供。

1.4 統(tǒng)計學處理

建立EXCEL數(shù)據(jù)庫，采用SPSS15.0進行卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 新生兒聽力篩查結果

在進行了耳聾基因與聽力篩查聯(lián)合分析的6242例新生兒中，初篩未通過446例，初篩陽性率7.15%。初篩未通過者在29-42天時接受復篩，復篩未通過103例，復篩陽性率1.65%。聽力篩查未通過者中有63例進行了聽力診斷，最終確診13例耳聾患者，分別為雙耳極重度感音神經(jīng)性耳聾2例，左耳極重度感音神經(jīng)性耳聾/右耳中重度感音神經(jīng)性耳聾1例，右耳極重度耳聾1例，左耳重度感音神經(jīng)性耳聾1例，雙耳中度感音神經(jīng)性耳聾4例，右耳中度耳聾1例，雙耳輕中度耳聾1例，雙耳輕度聽力損失1例，左耳聽反應域輕度異常1例。

2.2 新生兒耳聾基因篩查結果

共完成33810例新生兒檢測，檢出耳聾基因突變新生兒1129例，其中GJB2c.235delC純合突變3例，雙雜合突變13例，詳見表1。另發(fā)現(xiàn)線粒體基因突變72例，包括線粒體DNA均質突變49例，異質突變23例。

以等位基因計算，共發(fā)現(xiàn)突變等位基因1145個，突變攜帶率約為3.39%（1145/33810），其中GJB2突變攜帶率約為1.96%（661/33810），SLC26A4突變攜帶率約為1.08%（364/33810），線粒體12SrRNA突變攜帶率約為0.22%（74/33810），GJB3突變攜帶率約為0.14%（46/33810），詳見表2。在進行檢測的9個位點中，排在前五位的突變位點依次 是 c.235delC、IVS7-2A＞G、c.299_300delAT、m.1555A＞G、及c.2168A＞G。

2.3 新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查結果

6242 例新生兒聽力與耳聾基因聯(lián)合篩查結果顯示，基因篩查通過的5937例新生兒中，聽力篩查通過5855例，未通過率1.38%，基因篩查未通過的305例新生兒中，聽力篩查通過284例，未通過率6.89%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（χ2=54.153，P＜0.01)。

305 例基因篩查未通過新生兒中有GJB2基因突變162例，包括c.235delC雜合突變140例、c.299_300delAT雜合突變17例、c.176_197del雜合突變2例、c.235delC純合突變3例，其中純合突變有3例沒有通過聽力篩查，雜合突變有15例沒有通過聽力篩查，未通過率11.11%；SLC26A4基因突變有59例，其中IVS7-2A＞G雜合突變52例，c.2168A＞G雜合突變7例，有1例未通過聽力篩查，未通過率1.69%；m.1555A＞G突變有40例，其中均質突變28例，異質突變12例，全部通過聽力篩查；GJB3基因的c.538C＞T雜合突變有31例，全部通過聽力篩查。13例雙雜合突變中有2例c.235delCIVS7-2A＞G未通過聽力篩查，未通過率15.38%。聽力篩查未通過者中有63例進行了聽力診斷，最終確診13例耳聾患者，其中有4例基因未通過，分別為c.235delC純合突變3例和c.235delCIVS7-2A＞G雙雜合突變1例，其余9例均未發(fā)現(xiàn)檢測范圍內的基因突變。

3 討論

表1 純合及雙雜合突變病例情況Table 1 Cases of homozygous and heterozygous in various genes

導致聽力障礙的因素較為復雜，有遺傳因素、環(huán)境因素或者兩者共同作用，其中遺傳因素約占50%～60%[3]，而由此導致的新生兒聽力障礙目前無理想治療措施，但可控可防，即通過對攜帶耳聾基因突變的新生兒進行預防指導，可避免或推遲耳聾的發(fā)生，但耳聾基因及突變譜存在地域和種族差異[4-5]，因此，基因檢測對降低耳聾的發(fā)生率具有重要意義。本次研究共完成東莞戶籍新生兒檢測33810例，檢出攜帶者1129例，約占總數(shù)的3.34%，4個基因9個突變熱點共檢出1145個，突變率約為3.39%，該數(shù)據(jù)低于文獻報道的4.17%～5.15%[6-8，10-11]。

表2 4種基因9個位點的突變攜帶率Table 2 The carrie rate of nine hot spots

表2顯示，4個基因突變檢出率從高到低依次為GJB2、SLC26A4、線粒體12SrRNA和GJB3，基因突變位點頻率前5位依次為c.235delC、IVS7-2A＞G、c.299_300delAT、m.1555A＞G及c.2168A＞G，與文獻相似[7,9,10]。但具有特點，其中共檢出GJB2基因突變者658例（58.28%），該基因的攜帶率約為1.96%，其中c.235delC約占突變數(shù)的86.84%，高于文獻報道[9,12]，而c.299_300delAT和c.176_191del16突變率顯著低于文獻報道[6-8]，提示東莞地區(qū)戶籍人群以c.235delC為突變熱點。SLC26A4是僅次于GJB2的感音神經(jīng)性耳聾遺傳基因，是遲發(fā)性耳聾發(fā)生的重要基因，本次檢出364例突變攜帶者，占總突變人群的32.24%，突變攜帶率約為1.08%，低于文獻報道的1.50%～2.07%[6,7,10]。GJB3基因突變共檢出46例，占總突變人群的4.07%，突變攜帶率約為0.14%，低于文獻報道的0.295%～0.32%[6-7]。東莞戶籍新生兒耳聾基因突變的這些獨特性可能與以下原因有關：首先是地域性，東莞地處珠江口東岸，是嶺南文化發(fā)源地，同時也是我國改革開放的先行地，是我國移民第二多城市，僅次于深圳，總人口1000萬左右，但戶籍人口僅占約20%，本研究為盡可能保證遺傳背景的一致性，選擇夫妻雙方或一方為東莞戶籍的新生兒作為檢測對象，但并非均為土著居民，遺傳背景并不完全一致。其次，本次為大規(guī)模樣本研究，而文獻報道均為小樣本研究。最后，本次僅對導致耳聾的4個基因9個位點進行檢測，而與聽力相關基因突變位點高達100余個，因此，作者無法排除本地區(qū)是否存在其他基因突變的可能性。

另外，從表1中作者發(fā)現(xiàn)，耳聾基因也具有遺傳異質性。表1中7例GJB2基因的c.235delC和SLC26A4基因的IVS7-2A＞G雙重雜合突變，在未通過聽力篩查的2例中，僅有1例診斷為左耳極重度感音神經(jīng)性耳聾，右耳中重度感音神經(jīng)性耳聾，并佩戴了助聽器，而另1例卻無聽力障礙臨床癥狀，此例雖然未通過首次聽力篩查，但經(jīng)6個月后的隨訪證實對聲音反應良好，其他5例均通過聽力篩查。其可能的原因是：1.致聾的患兒攜帶有其它位點突變；2.受環(huán)境影響致聾[8,13-16]。

本研究顯示，6242例進行聯(lián)合篩查的新生兒中有305例未通過基因檢測，聽力篩查未通過21例，漏檢284例，大部分基因攜帶者、藥物性耳聾患兒均通過了聽力篩查，但在其成長過程中受外界環(huán)境影響可導致聽力損傷甚至終生耳聾，比如線粒體DNA12SrRNA突變?yōu)槟赶颠z傳，其子代均為突變基因攜帶者，使用氨基糖苷類抗生素可導致不可逆轉的聽力殘疾[17-19]，又如GJB3基因突變可引起常染色體顯性或隱性遺傳性非綜合征耳聾，與高頻聽力下降有關[20,21]，且有GJB2/GJB3雙雜合突變致病的模式[22]，故需定期進行聽力監(jiān)測。進行基因檢測不僅可以明確病因，還可以有針對性地對高危人群進行用藥指導、行為指導以及婚育指導，可見耳聾基因篩查是早期發(fā)現(xiàn)遲發(fā)性耳聾和藥物性耳聾的有效手段。但由于基因篩查無法發(fā)現(xiàn)由耳部結構畸形、分泌性中耳炎等非遺傳因素導致的耳聾，同時由于檢測位點的局限性，也會造成部分患者的漏診，本文中有未通過聽力篩查的新生兒103例，其中僅21例攜帶致病突變，而確診的13例患者有9例未檢測出基因突變；可見兩種方法具有互補性。

耳聾基因篩查是早期發(fā)現(xiàn)新生兒聽力障礙的重要輔助檢測方法，本次研究基本明確了東莞地區(qū)遺傳性耳聾的突變分布情況。另外，聽力篩查和耳聾基因篩查具有很好的互補性，通過聯(lián)合篩查能夠從分子水平發(fā)現(xiàn)有可能存在聽力損傷的新生兒，對藥物性耳聾高?；純旱慕K生用藥提供指導，減少遲發(fā)性耳聾高危新生兒的發(fā)病率和降低患兒的聽力損失嚴重程度，并能及時對患兒聽力狀況作出評估，有助于降低耳聾出生缺陷率；對遺傳性耳聾高?；純哼M行定期聽力檢查，為早期發(fā)現(xiàn)、預測耳聾的發(fā)生及制定干預措施提供了有利的參考，對降低耳聾發(fā)病率有重要意義[23-24]。

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