于曉宇 林妘 許軍 楊濤 吳皓

上海交通大學醫(yī)學院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學醫(yī)學院耳科學研究所上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學重點實驗室

大前庭導(dǎo)水管（Enlarged vestibular aqueduct,EVA）是與兒童感音神經(jīng)性聾相關(guān)的最常見的內(nèi)耳畸形[1]。大部分EVA患者表現(xiàn)為非綜合征型耳聾(DFNB4,OMIM#600791），少部分同時合并甲狀腺腫大，稱Pendred綜合征（Pendred syndrome,PDS,OMIM274600）。研究表明，SLC26A4的雙等位基因突變是導(dǎo)致EVA的主要病因[2,3]。SLC26A4基因有21個外顯子，編碼含780個氨基酸的多次跨膜蛋白Pendrin.Pendrin表達于內(nèi)耳、甲狀腺和腎臟，能夠介導(dǎo) Cl-、I-、OH-、HCO3-等陰離子的轉(zhuǎn)運[4,5]。至今已報道有近200種SLC26A4基因的致病突變，其突變譜在不同的地區(qū)和種族中存在差異。例如，SLC26A4基因的熱點突變在白種人中為p.L236P,p.T416P和c.1001+1G＞A[6]，在日本和韓國人中為p.H723R[7,8]，而中國人群中，c.919-2A＞G突變最常見[9]。同時，SLC26A4基因突變的檢出率也存在種族差異，據(jù)報道SLC26A4雙等位突變的檢出率在北美白種人為33%，而在中國漢族EVA患者中攜帶SLC26A4雙等位突變的占88%。本研究旨在通過對中國華東地區(qū)135例非綜合征性EVA耳聾先證者進行SLC26A4基因突變檢測，進一步了解EVA耳聾患者SLC26A4基因突變檢出率和突變譜，為指導(dǎo)臨床基因診斷和遺傳咨詢提供線索和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本研究的135例研究對象為2009年10月至2017年1月就診于上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科耳科學或遺傳學門診的EVA耳聾患者。所有患者均經(jīng)高分辨率顳骨CT或者磁共振成像(MRI)診斷為EVA，診斷依據(jù)為軸位CT掃描顯示患者前庭總腳至前庭水管外口之間中點的最大管徑寬度＞1.5 mm[10]。對所有研究對象均進行詳細的病史詢問及體格檢查以排除其他致病因素造成的聽力損失和綜合征性耳聾。聽力學檢查根據(jù)患者的年齡和配合程度選擇純音測聽、行為測聽或聽覺腦干反應(yīng)(Auditory brainstem response,ABR)檢測。聽力損失程度的分級根據(jù)2003年Van camp等[11]歐洲工作組倡導(dǎo)的遺傳性耳聾的分級標準：輕度（20～ 40 dB HL）、中度（41～70 dB HL）、重度（71～95 dB HL）及極重度（＞95 dB HL）。本研究通過上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院倫理委員會的批準，所有研究對象均被詳細告知權(quán)利和風險，并由本人或法定監(jiān)護人簽署書面知情同意書。

2 方法

2.1 DNA提取

使用天根生化科技（北京）有限公司的基因組DNA提取試劑盒，參照試劑盒內(nèi)說明書從全血中提取基因組DNA，并利用NanoDrop 2000超微量紫外分光光度計對所提DNA進行含量和純度檢測。

2.2 巢式聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)和Sanger測序

針對SLC26A4基因的編碼區(qū)及側(cè)翼序列分別設(shè)計巢式PCR引物進行分段擴增，根據(jù)引物參數(shù)確定最佳反應(yīng)條件。PCR所使用引物序列、試劑、反應(yīng)條件和反應(yīng)體系詳見柴永川等[12]。所得巢式PCR產(chǎn)物直接由上海杰李生物技術(shù)有限公司進行Sanger測序，并使用Sequencher 4.9序列分析軟件對測序結(jié)果進行分析。

2.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS 20統(tǒng)計學軟件中的秩和檢驗對攜帶不同數(shù)量SLC26A4突變的EVA患者的聽力損失程度進行統(tǒng)計分析。P＜0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

本研究共收集到符合EVA診斷標準的先證者135例，其中男性67例，女性68例，患者年齡1月～32歲，中位年齡4歲。SLC26A4基因編碼區(qū)突變檢測在135例EVA耳聾患者中共檢測出存在于210等位基因上的51種突變，其中，最常見的是剪切位點突變c.919-2A＞G，占總檢出突變的50%(105/210)，其次是錯義突變p.H723R，占10.48%(22/210)。所有先證者中，74.07%（100/135）的患者攜帶有SLC26A4雙等位基因突變，7.41%的（10/135）的先患者攜帶SLC26A4單等位基因突變，而18.52%（25/135）的患者未檢測到任何SLC26A4基因突變。135例患者的SLC26A4基因突變情況詳見表1。聽力學資料顯示，攜帶有SLC26A4雙等位基因突變、單等位基因突變和無SLC26A4基因突變的3組先證者的聽力損失程度無明顯統(tǒng)計學差異(見表2)。

表1 135例EVA耳聾患者SLC26A4基因外顯子突變篩查結(jié)果Table1 SLC26A4 coding region mutations in 135 probands with non-syndromic EVA

Allele 1 p.L676Q p.M147V p.N392Y p.N392Y p.Q446X p.R409C p.T410M p.T410M V659L c.1548insC c.1707+5G＞A c.414delT c.915-916insG c.915-916insG c.919-2A＞G c.915insG p.H723R p.S532R p.V163I p.V412I none Total Allele 2 p.H723R p.H723R p.I529S p.S532R p.H723R p.H723R p.D661Y p.H723R N392Y+K77I p.N392Y p.V650D p.N392Y p.M147V c.1707+5G＞A none none none none none none none Number of subjects(%)1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）5（3.70）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）1（0.74）25（18.52）135（100）

表2 SLC26A4雙等位基因突變、單等位基因突變及無SLC26A4基因突變患者的聽力損失程度Table 2 Severity of hearing loss in subjects with two,one or zero SLC26A4 mutations

4 討論

SLC26A4是EVA耳聾患者主要的致病基因。自從1997年被鑒定以來，在世界范圍內(nèi)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)近200種SLC26A4致病突變類型，但已報道的EVA耳聾患者SLC26A4基因的突變率和熱點突變存在著明顯的地域和種族差異。本文通過對華東地區(qū)135例散發(fā)EVA耳聾先證者的SLC26A4基因篩查研究共檢測出51種突變，其中最常見的是剪切位點突變c.919-2A＞G和錯義突變p.H723R，分別占總檢出突變的50%和10.48%，與之前華北地區(qū)及臺灣地區(qū)的報道一致[2,9]。與之前報道不同的是EVA耳聾先證者中未檢出SLC26A4雙等位基因突變的患者比例。Wang等[9]報道的非SLC26A4雙等位基因突變的EVA耳聾患者比例為11.6%，包含9.5%SLC26A4單等位基因突變的病例和2.1%的未檢出SLC26A4等位基因突變的病例；Chen等[13]報道的中國臺灣地區(qū)EVA耳聾患者中，SLC26A4單等位基因突變的病例占24%，未見SLC26A4等位基因突變的病例占14%，而本研究顯示華東地區(qū)未檢出SLC26A4突變的EVA患者比例較高，存在這種差異可能有兩個原因：1.樣本人群的地域和民族差異。中國是一個地域廣闊的多民族國家，南北方之間及不同民族之間可能存在著一定的遺傳差異。2.樣本中所含家族性EVA耳聾患者的比例不同，本研究中有EVA家族史的患者僅有4例，低于之前報道中有EVA家族史的患者例數(shù)。

EVA耳聾作為隱性遺傳疾病，有一部分患者在主要致病基因SLC26A4編碼區(qū)未檢出雙等位基因突變，提示可能存在其他遺傳因素在EVA耳聾中起著重要作用，如SLC26A4基因大片段缺失、內(nèi)含子突變、SLC26A4基因調(diào)控序列突變以及SLC26A4基因之外其它致病基因的影響。以上假設(shè)已在部分研究中得到證實，例如Pique等[14]利用多重連接探針擴增技術(shù)(Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification,MLPA)發(fā)現(xiàn)1例（1/107）攜帶SLC26A4單雜合突變的患者存在SLC26A4基因的雜合大片段缺失g.8091T-22145Cdel突變；Yang等研究證實，SLC26A4基因的啟動子突變以及轉(zhuǎn)錄因子FOXI1和內(nèi)向整流鉀例子通道KCNJ10均能以SLC26A4/FOXI1或SLC26A4/KCNJ10雙基因雜合突變形式導(dǎo)致EVA耳聾的發(fā)生[15,16]。本研究未能對SLC26A4基因啟動子、大片段缺失以及FOXI1、KCNJ10基因進行檢測，但之前研究提示中國漢族人群上述基因突變率很低[17]。盡管如此，對于未能檢測出SLC26A4雙等位基因突變的EVA患者仍需考慮這些基因致病的可能性，同時也有必要進一步探索與EVA相關(guān)的其他未知致病基因。

綜上所述，本研究通過對華東地區(qū)135例非綜合征性EVA耳聾先證者SLC26A4基因篩查證實SLC26A4基因的熱點突變方式為c.919-2A＞G和p.H723R，對臨床EVA耳聾的基因篩查和診斷具有一定參考價值。同時本研究發(fā)現(xiàn)EVA耳聾先證者中非SLC26A4雙等位基因突變的患者比例較高，并且這部分患者的聽力損失程度與SLC26A4雙等位基因突變的患者相比沒有顯著差異，提示可能存在其他致病因子在EVA綜合征耳聾的發(fā)生發(fā)展中起到重要的作用。未來研究需要進一步探索導(dǎo)致EVA的新致病因素，促使建立在基因診斷基礎(chǔ)上的遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷更加準確和完善。

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