嚴(yán)爽 火子榕 尹曉玲 張治華

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院耳科學(xué)研究所上海市耳鼻疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

前庭神經(jīng)鞘膜瘤（vestibular schwannoma,VS），即聽神經(jīng)瘤，起源于前庭神經(jīng)鞘膜雪旺細(xì)胞，主要位于內(nèi)聽道及橋小腦角，占該區(qū)域良性腫瘤的80-90%[1]。受顱內(nèi)空間的制約，瘤體在生長過程中壓迫顱內(nèi)重要結(jié)構(gòu)，累及第V、VII-XI對顱神經(jīng)，以及小腦、腦干等，產(chǎn)生嚴(yán)重中樞及顱神經(jīng)壓迫癥狀。早期研究發(fā)現(xiàn)，VS具有生長、靜止和縮小三種典型生長方式，近年來，國內(nèi)外臨床研究發(fā)現(xiàn)并關(guān)注VS的第四種生長方式，即囊性變，占5.7-48%[2-6]。囊性前庭神經(jīng)鞘膜瘤（cystic vestibular schwannoma,CVS）[5-7]具有特殊生物學(xué)行為和臨床癥狀：1）生長更迅速、癥狀更嚴(yán)重：導(dǎo)致更多突發(fā)性耳聾、面癱、腦積水等嚴(yán)重癥狀；2）更具侵襲性：腫瘤囊壁與毗鄰顱神經(jīng)、腦干嚴(yán)重粘連，術(shù)中神經(jīng)解剖保留幾率低，術(shù)后面聽神經(jīng)功能不可逆損傷；3）治療策略單一且療效不佳：其腫瘤全切率、術(shù)后并發(fā)癥率及面聽神經(jīng)功能保留率等療效指標(biāo)均不佳，顯著低于實(shí)性前庭神經(jīng)鞘膜瘤（solid vestibular schwannoma,SVS）。闡明CVS的病理、發(fā)生機(jī)制具有重要的臨床意義。

VS生物學(xué)特性受眾多因素影響。腫瘤的生長受自噬的調(diào)控，自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要機(jī)制，貫穿于生命活動(dòng)中許多重要的病理生理過程[8]。生理水平的自噬對細(xì)胞的基因組完整性和內(nèi)穩(wěn)態(tài)維持是必需的，也參與了抗衰老、免疫及胞內(nèi)病原體清除、癌變及神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變等生理或病理過程[9]。自噬功能正常及適度增強(qiáng)可維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，利于細(xì)胞生存，自噬失調(diào)則會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞的變性壞死。

作為橋小腦角最常見的良性腫瘤，VS的發(fā)生和發(fā)展中是否有自噬的調(diào)控，目前尚無明確報(bào)道?；谠摫尘埃瑸榱颂接慍VS和SVS超微病理及生物學(xué)特性的差異性，探究自噬在VS囊性變發(fā)展過程中的作用，本研究擬通過透射電子顯微鏡技術(shù)對30例前庭神經(jīng)鞘膜瘤（CVS 15例，SVS 15例）超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析，利用免疫組織化學(xué)技術(shù)標(biāo)記特異性抗原，觀察自噬標(biāo)記蛋白LC3在腫瘤組織中的表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 病例資料

收集2016年6月至2016年12月于上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科手術(shù)治療的散發(fā)性VS患者，剔除神經(jīng)纖維瘤病II型（NF2）、立體定向放射治療或手術(shù)治療后復(fù)發(fā)患者，所有患者臨床診斷均依據(jù)內(nèi)聽道增強(qiáng)MRI中的特征性表現(xiàn)，術(shù)后常規(guī)病理結(jié)果為最終確診依據(jù)。納入研究的患者共計(jì)30例（CVS 15例，SVS 15例）。

1.2 標(biāo)本準(zhǔn)備及處理

所有標(biāo)本均取自手術(shù)切除5分鐘之內(nèi)的新鮮腫瘤組織，取下后腫瘤組織分別置于盛有4%多聚甲醛和2.5%戊二醛的EP管中固定（CVS瘤體及囊壁分開取材并固定）。

1.3 透射電子顯微鏡技術(shù)

對2.5%戊二醛固定的腫瘤樣本進(jìn)行包埋：經(jīng)0.1M的磷酸緩沖液清洗3次后，再用1%鋨酸于4℃下振蕩固定3 h；用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗3次，乙醇逐級脫水，環(huán)氧丙烷置換，Spurr樹脂浸透包埋；在70℃烘箱中聚合。切片染色觀察：將包埋塊置于超薄切片機(jī)上進(jìn)行切片，超薄切片厚度70 nm，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色，透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 免疫組織化學(xué)技術(shù)

取經(jīng)4%多聚甲醛固定后的腫瘤樣本進(jìn)行石蠟包埋，分別切片，厚度為4μm。石蠟切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫蠟水化。對切片用0.01mol/L檸檬酸緩沖液進(jìn)行經(jīng)抗原修復(fù)后使用免疫組化試劑盒（上海明睿生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，LC3單克隆抗體購自上海優(yōu)寧維生物科技股份有限公司，并按照1:50的比例稀釋，4℃孵育過夜，PBS清洗后滴加生物素標(biāo)記的二抗（濃度為1:100），37℃孵育30分鐘，DAB顯色15min,自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，二甲苯透明,樹脂封片，光鏡下觀察、拍照。

自噬標(biāo)記蛋白LC3陽性為細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）或細(xì)胞間質(zhì)（intercellular matrix）呈棕黃色染色，通過對表達(dá)強(qiáng)度與反應(yīng)細(xì)胞的百分比對免疫反應(yīng)進(jìn)行半定量評估，即為10個(gè)高倍視野（約1000個(gè)細(xì)胞）中出現(xiàn)的LC3陽性細(xì)胞數(shù)（百分率表示）。強(qiáng)度評估：沒有；輕：細(xì)胞＜5O個(gè)/10 HPF；中：細(xì)胞5O～100個(gè)/10 HPF；強(qiáng)：細(xì)胞＞100個(gè)/10 HPF。對沒有及輕度表達(dá)認(rèn)定為陰性，對中度表達(dá)及強(qiáng)表達(dá)認(rèn)定為陽性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均錄入SPSS 23.0軟件進(jìn)行處理分析，連續(xù)型變量用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，非參數(shù)檢驗(yàn)按實(shí)際情況采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P＜0.05表示結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般臨床資料

在30例患者中，男性11例（36.7%），女性16例（53.3%）；患者平均年齡為33.2±9.4歲（21～59歲）；腫瘤直徑平均為26.7±8.4 mm（14～47 mm）。

2.2 電鏡下超微病理組織學(xué)結(jié)果

電子顯微鏡觀察超微病理，在電鏡下,SVS瘤體細(xì)胞主要表現(xiàn)為細(xì)胞平行排列或散在分布，胞漿少，瘤細(xì)胞突起長，部分瘤細(xì)胞核形態(tài)異常、核仁大，未見自噬小體，見圖1a。CVS瘤體細(xì)胞則表現(xiàn)為細(xì)胞散在分布，細(xì)胞線粒體腫脹，嵴消失，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，核周間隙擴(kuò)大，呈水樣變性改變,胞漿內(nèi)可見空泡及大量脂滴，可見典型自噬溶酶體，自噬溶酶體也被稱為晚期自噬小泡或降解型自噬小泡(degradative autophagic vacuole,AVd)，由于與溶酶體融合，包裹的內(nèi)容物及雙層膜均已被溶酶體中的蛋白酶降解，見圖1b。CVS囊壁可見到瘤細(xì)胞稀疏、大小不等，間質(zhì)內(nèi)存在血竇，竇內(nèi)皮細(xì)胞肥大,毛細(xì)血管擴(kuò)張，可見典型自噬小體，自噬小體也被稱為起始自噬小泡(initial autophagic vacuoles,AVi)，具有雙層膜結(jié)構(gòu)，自噬小體中包裹了胞漿中的內(nèi)容物及細(xì)胞器，這些組分形態(tài)完整，與細(xì)胞中其他位置的胞漿內(nèi)容物和細(xì)胞器形態(tài)相似。見圖1c。

2.3 免疫組織化學(xué)結(jié)果

自噬標(biāo)記蛋白LC3陽性為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞間質(zhì)呈棕黃色染色，在各15例囊/實(shí)性前庭神經(jīng)鞘膜瘤組織中，SVS中LC3表達(dá)陽性1例，CVS中，LC3在CVS瘤體中表達(dá)陽性11例，在CVS囊壁中表達(dá)陽性14例，LC3在SVS瘤體、CVS瘤體及CVS囊壁中的陽性率分別為13.3%，60.0%，和73.3%，SVS瘤體中，LC3表達(dá)量顯著低于CVS瘤體（P=8×10-4）及CVS囊壁（P=1.2×10-5），光鏡下典型表現(xiàn)如圖2所示。

3 討論

前庭神經(jīng)鞘膜瘤囊性變機(jī)制至今未明，以往的學(xué)者[10-12]從組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞分布、蛋白表達(dá)等現(xiàn)象中進(jìn)行分析，最新研究[13]通過cDNA芯片檢測CVS和SVS組織中的差異基因表達(dá)譜提出差異表達(dá)基因在VS囊性變中具有重要作用。

本研究利用透射電子顯微鏡技術(shù)對30例VS（SVS 15例，CVS 15例）超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察分析，通過免疫組織化學(xué)技術(shù)標(biāo)記特異性抗原，觀察自噬標(biāo)記蛋白LC3在腫瘤組織中的表達(dá)，第一次提出并假設(shè)自噬與VS囊性變之間的關(guān)系。

自噬是細(xì)胞自己吞噬自己的一個(gè)過程,由雙層或多層膜的小泡將細(xì)胞質(zhì)成分包裹，運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解。自噬是維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要機(jī)制，貫穿于生命活動(dòng)中許多重要的病理生理過程，在多種腫瘤中都存在著自噬水平的改變，不同腫瘤類型，腫瘤發(fā)生發(fā)展的不同階段，自噬發(fā)揮的作用會(huì)有所不同[14-15]。自噬在腫瘤形成和演進(jìn)過程中是一把雙刃劍，可以發(fā)揮促進(jìn)與抑制的不同作用。自噬抑制腫瘤功能的具體機(jī)制仍未闡明。自噬相關(guān)基因（autophagy-related gene,ATG）參與多條抑癌信號通路，清除細(xì)胞內(nèi)代謝廢物、長壽命蛋白及受損的細(xì)胞器以避免有害自由基及突變的發(fā)生，減少DNA損傷從而穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，抑制細(xì)胞癌變[16-17]。自噬減少時(shí)，細(xì)胞內(nèi)衰老的細(xì)胞器和功能喪失的長壽蛋白無法降解，使細(xì)胞內(nèi)代謝障礙，直接或間接造成DNA損傷和基因突變，導(dǎo)致功能喪失致細(xì)胞惡變。此外，過度自噬能夠作為一種細(xì)胞預(yù)死亡機(jī)制而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的損傷。自噬水平過高時(shí)，自噬誘導(dǎo)凋亡性細(xì)胞死亡來抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，被認(rèn)為是Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡[18]，稱為自噬性細(xì)胞死亡。有研究表明，通過抑制PI3K／Akt／mTOR通路來提高自噬流可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[19]。腫瘤的促癌機(jī)制主要是高水平的自噬會(huì)幫助腫瘤細(xì)胞利用自噬機(jī)制對抗由于快速分裂和供血不足引起的營養(yǎng)缺乏和缺氧。腫瘤生長過程中，由于腫瘤細(xì)胞快速增殖和代謝，而新生血管形成卻相對滯后，容易出現(xiàn)缺氧、營養(yǎng)缺乏等狀況，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞處于饑餓、缺氧狀態(tài)。在這種情況下，腫瘤細(xì)胞能夠通過自噬大量降解細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)，循環(huán)利用營養(yǎng)物質(zhì)，為代謝相關(guān)通路提供原料，促進(jìn)低氧和營養(yǎng)受限的腫瘤細(xì)胞的存活[20]。

圖1 電鏡下前庭神經(jīng)鞘膜瘤組織超微病理結(jié)構(gòu)表現(xiàn)Fig.1 Ultrastructure of vestibular schwannoma under electron microscope

圖2 光鏡下前庭神經(jīng)鞘膜瘤組織LC3免疫組化表現(xiàn)Fig.2 Immunohistochemical staining features of LC3 in ves-

目前關(guān)于前庭神經(jīng)鞘膜瘤與自噬之間的關(guān)系尚未清楚，最新研究[21]在使用整合素連接激酶（integrin-linked kinase，ILK）抑制劑 OSU-T135對HEI193細(xì)胞進(jìn)行處理后發(fā)現(xiàn)caspases-9與LC3-B的表達(dá)水平均增高，認(rèn)為OSU-T135能夠通過抑制聽神經(jīng)瘤AKT信號通路的活性以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、使細(xì)胞分裂阻滯在G2期，并最終引起自噬失調(diào)而致細(xì)胞死亡。該團(tuán)隊(duì)亦指出[22]PAK抑制劑能夠能通過引起HEI193細(xì)胞有絲分裂障礙而引起ATG5以及自噬體的增多并最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡。這均提示自噬可能在前庭神經(jīng)鞘膜瘤發(fā)生發(fā)展以及治療過程起調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，與SVS瘤體相比，光鏡下CVS瘤體及囊壁組織疏松，瘤細(xì)胞稀少，細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞間有許多空泡，排列成稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，呈退行性改變；透射電子顯微鏡下，CVS瘤體及囊壁均可見典型自噬體，SVS瘤體中未見；免疫組織化學(xué)技術(shù)標(biāo)記特異性抗原后，亦證實(shí)自噬標(biāo)記蛋白LC3在CVS中高表達(dá)。自噬水平的改變與多種病理生理過程相關(guān)，我們認(rèn)為，自噬可能在前庭神經(jīng)鞘膜瘤囊性變中也發(fā)揮著重要作用，但其中確切機(jī)制尚無定論，例如究竟自噬水平的改變造成VS囊性變的發(fā)生還是VS囊變后導(dǎo)致自噬水平的提高，以及自噬調(diào)控VS囊性變的具體信號通路。今后這些問題的解決可能為指導(dǎo)前庭神經(jīng)鞘膜瘤的臨床治療提供更大價(jià)值，未來仍需更多研究來闡明如何有效利用自噬協(xié)助治療前庭神經(jīng)鞘膜瘤。

參考文獻(xiàn)

1 Wong BY,Capper R.Incidence of Vestibular Schwannoma and Inci Dental Findings on the Magnetic Resonance Imaging and Computed Tomography Scans of Patients from a Direct Referral Audiology Clinic[J].The Journal of laryngology and otology.2012;126(7):658-662.

2 Huo Z,Zhang Z,Huang Q,et al.Clinical Comparison of Two Subtypes of Cystic Vestibular Schwannoma:Surgical Considerations and Outcomes[J].Head and Neck Surgery.2016;273(12):4215-4223.

3 Piccirillo E,Wiet MR,Flanagan S,et al.Cystic Vestibular Schwannoma:Classification,Management,and Facial Nerve Outcomes[J].Otology&neurotology.2009;30(6):826-834.

4 Sinha S,Sharma BS.Cystic Acoustic Neuromas:Surgical Outcome in a Series of 58 Patients[J].Journal of Clinical Neuroscience.2008;15(5):511-515.

5 Benech F,Perez R,Fontanella MM,et al.Cystic Versus Solid Vestibular Schwannomas:a Series of 80 Grade III-IV Patients[J].Neurosurgical Review.2005;28(3):209-213.

6 Fundova P,Charabi S,Tos M,et al.Cystic Vestibular Schwannoma:Surgical Outcome[J].The Journal of Laryngology and Otology.2000;114(12):935-939.

7 Zhang Z,Wang Z,Huang Q,et al.Removal of Large or Giant Sporadic Vestibular Schwannomas Via Translabyrinthine Approach:aAreport of 115 Cases[J].ORL.2012;74(5):271-277.

8 Galluzzi L,Baehrecke EH,Ballabio A.Molecular definitions of autophagy and related processes[J].2017;36(13):1811-1836.

9 Galluzzi LVitale I,Aaronson SA,et al.Molecular Mechanisms of Cell Death:Recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death 2018[J].Cell death and differentiation.2018;25(3):486-541

10 Moon KS,Jung S,Seo SK,et al.Cystic Vestibular Schwannomas:a Possible Role of Matrix Metalloproteinase-2 in Cyst Development and Unfavorable Surgical Outcome[J].Journal of Neurosurgery.2007;106(5):866-871.

11 Schober R,Vogeley KT,Urich H,et al.Vascular Permeability Changes in Tumours of the Peripheral Nervous System[J].Virchows Archiv A,Pathological Anatomy and Histopathology.1992;420(1):59-64.

12 Park CK,Kim DC,Park SH,et al.Microhemorrhage,a Possible Mechanism for Cyst Formation in Vestibular Schwannomas[J].Journal of Neurosurgery.2006;105(4):576-580.

13 Zhang Z,Wang Z,Sun L,et al.Mutation Spectrum and Differential Gene Expression in Cystic and Solid Vestibular Schwannoma[J].Genetics in Medicine.2014;16(3):264-270.

14 Levine B,Sinha S,Kroemer G.Bcl-2 Family Members:Dual Regulators of Apoptosis and Autophagy[J].Autophagy.2008;4(5):600-606.

15 Maycotte P,Jones KL,Goodall ML,et al.Autophagy Supports Breast Cancer Stem Cell Maintenance by Regulating IL6 Secretion[J].Molecular cancer research.2015;13(4):651-658.

16 Mathew R,Karp CM,Beaudoin B,et al.Autophagy Suppresses Tumorigenesis Through Elimination of p62[J].Cell.2009;137(6):1062-1075.

17 Cheong H.Integrating Autophagy and Metabolism in Cancer[J].Archives of pharmacal research.2015;38(3):358-371.

18 Su Z,Yang Z,Xu Y,et al.Apoptosis,Autophagy,Necroptosis,and Cancer Metastasis[J].Molecular Cancer.2015;14:48.

19 Singh BN,Kumar D,Shankar S,et al.Rottlerin Induces Autophagy Which Leads to Apoptotic Cell Death Through Inhibition of PI3K/Akt/mTOR Pathway in Human Pancreatic Cancer Stem Cells[J].Biochemical Pharmacology.2012;84(9):1154-1163.

20 Strohecker AM,Guo JY,Karsli-Uzunbas G,et al.Autophagy Sustains Mitochondrial Glutamine Metabolism and Growth of BrafV600E-driven Lung tumors[J].Cancer Discovery.2013;3(11):1272-1285.

21 Mercado-Pimentel ME,Igarashi S,Dunn AM,et al.The Novel Small Molecule Inhibitor,OSU-T315,Suppresses Vestibular Schwannoma and Meningioma Growth by Inhibiting PDK2 Function in the AKT Pathway Activation[J].Austin Journal of Medical oncology.2016;3(1):1025.

22 Mercado-Pimentel ME,Miller C,Rolph DN,et al.Inhibiting p21-Activated Kinase Induces Cell Death in Vestibular Schwannoma and Meningioma via Mitotic Catastrophe[J].Otology&neurotology.2017;38(1):139-146.