劉穎迪 柏冰雪 任靜 馬良娟

024000內(nèi)蒙古，赤峰市醫(yī)院皮膚科（劉穎迪）；哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院皮膚科（柏冰雪、任靜、馬良娟）

皮膚光損傷的基礎(chǔ)是日光紫外線照射，細(xì)胞受到光損傷后會誘發(fā)光老化和各種皮膚癌。皮膚發(fā)生光損傷主要是因為長波紫外線和中波紫外線（UVB），其中UVB因其損傷強(qiáng)度大，角質(zhì)形成細(xì)胞發(fā)生光損傷后產(chǎn)生一系列損傷因子作用于成纖維細(xì)胞，加重光老化［1］。因此，研究皮膚光老化防護(hù)對延緩皮膚衰老和預(yù)防皮膚良惡性腫瘤有重要意義。紫外線作用于皮膚引起細(xì)胞光損傷的一個重要機(jī)制是誘導(dǎo)活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）的產(chǎn)生［2］。膽綠素（biliverdin）是血紅素氧合酶催化血紅蛋白產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，在膽綠素的生物學(xué)作用中，其抗氧化作用尤為突出［3?4］。前期動物實驗中我們已經(jīng)證實，外源性膽綠素可以延緩UVB誘導(dǎo)的裸鼠慢性皮膚光老化［5］。本研究中，我們建立UVB光損傷細(xì)胞模型，在細(xì)胞和分子水平上研究膽綠素在細(xì)胞光損傷中的防護(hù)作用，并通過觀察膽綠素對抗氧化應(yīng)激的重要信號分子——核因子-紅細(xì)胞 2 相關(guān)因子 2（nuclear factor?erythroid 2?related factor?2，Nrf2）的影響探討膽綠素拮抗皮膚光損傷的機(jī)制。

材料與方法

一、細(xì)胞、主要試劑

HaCaT細(xì)胞由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院實驗室提供。膽綠素配制：膽綠素鹽酸鹽為美國Sigma公司產(chǎn)品，純度 ＞ 97.0%（10 mg；貨號30891），將其溶于2 mol/L NaOH溶液中，DMEM培養(yǎng)基產(chǎn)于美國HyClone公司。CCK8產(chǎn)于日本同仁公司；Nrf?2抗體產(chǎn)于美國CST公司；基質(zhì)金屬蛋白酶1（MMP?1）、MMP?3抗體產(chǎn)于武漢博士德生物工程有限公司。UVB燈管（K5B20H，波長290～320 nm，波峰313 nm）產(chǎn)自南京華強(qiáng)電子有限公司；紫外線照度表（UV340B）產(chǎn)自深圳欣寶瑞儀器有限公司。

二、細(xì)胞培養(yǎng)

取HaCaT細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、95%濕度及5%CO2條件下培養(yǎng)傳代。取對數(shù)生長期HaCaT細(xì)胞，經(jīng)0.5%胰蛋白酶和0.03%乙二胺四乙酸消化后，用DMEM培養(yǎng)基以1×105個/ml細(xì)胞密度接種于6孔板（用于Western印跡實驗）或96孔培養(yǎng)板（用于CCK8實驗）中，當(dāng)細(xì)胞融合至80%以上且處于對數(shù)生長期時處理，倒置顯微鏡下觀察HaCaT細(xì)胞的形態(tài)。

三、細(xì)胞分組和處理

將HaCaT細(xì)胞分為5組，對照組：不加膽綠素，不照射UVB；UVB組：30 mJ/cm2UVB照射，不加膽綠素；100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L 膽綠素 +UVB組：分別于30 mJ/cm2UVB照射前1 h加入相應(yīng)濃度膽綠素。各個孔板內(nèi)細(xì)胞生長融合至80%以上時，吸去UVB組和膽綠素+UVB組培養(yǎng)液，用PBS沖洗1次，并加入少量PBS覆蓋底面，用UVB照射，培養(yǎng)板距燈管15 cm，照射總劑量為30 mJ/cm2。照射完畢后，棄去PBS，重新加入新鮮的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

四、CCK8法檢測細(xì)胞生存率

上述各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，向每孔加入10 μl CCK8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標(biāo)儀450 nm波長處測定各孔吸光度（A值），細(xì)胞生存率=（實驗孔A值-空白孔A值）（/對照孔A值-空白孔A值）×100%。

五、Western印跡檢測MMP?1、MMP?3和Nrf?2蛋白表達(dá)

上述各組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加預(yù)冷的PBS沖洗3遍，加入含苯甲基磺酰氟的裂解液冰上裂解30 min，然后于4℃下12 830×g離心10 min，吸取上清液。二辛可酸法檢測總蛋白濃度。各組蛋白加入5×十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS?PAGE）蛋白上樣緩沖液，煮沸變性，SDS?PAGE（預(yù)制膠）上樣，使用聚偏二氟乙烯膜進(jìn)行濕轉(zhuǎn)后，5%脫脂牛奶封閉1 h，加相應(yīng)一抗4℃孵育過夜，二抗室溫孵育2 h，ECL發(fā)光液顯影，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀成像、拍照。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析采用SPSS 19.0軟件。數(shù)據(jù)用±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、UVB照射前后HaCaT細(xì)胞的形態(tài)變化

正常的HaCaT細(xì)胞形態(tài)飽滿，多角形，呈扁平鋪路石樣緊密排列。30 mJ/cm2UVB照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，HaCaT細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)成分縮減，邊緣銳利且細(xì)胞之間排列疏松。

二、膽綠素預(yù)處理、UVB照射對HaCaT細(xì)胞活力的影響

CCK8結(jié)果顯示，對照組、UVB組和100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L膽綠素 +UVB組細(xì)胞吸光度值分別為3.001±0.122、0.988±0.135、1.466±0.106、1.588± 0.118、1.943± 0.102（n=8）。與對照組比較，UVB組細(xì)胞生存率顯著降低（P＜0.05）；與UVB組比較，各濃度膽綠素+UVB組細(xì)胞生存率均升高（P＜0.05），各濃度膽綠素+UVB組間細(xì)胞生存率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

三、膽綠素抑制UVB誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中MMP?1和MMP?3蛋白表達(dá)

Western印跡結(jié)果顯示（圖1，表1），與對照組比較，UVB組MMP?1和MMP?3表達(dá)均增加（P＜ 0.01）；在加入100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L膽綠素預(yù)處理后，MMP?1、MMP?3蛋白表達(dá)與UVB組比較均下降（P＜ 0.05），且100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L膽綠素+UVB組組間MMP?1和MMP?3表達(dá)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

四、膽綠素誘導(dǎo)UVB照射HaCaT細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)

與對照組相比，UVB組HaCaT細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)降低（P＜ 0.05），而100 nmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L膽綠素+UVB組中Nrf2蛋白表達(dá)較UVB組增加（P＜0.01）。見圖1，表1。

圖1 5組HaCaT細(xì)胞中基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）?1、MMP?3及Nrf?2蛋白表達(dá)

表1 各組HaCaT細(xì)胞MMP?1、MMP?3及Nrf?2蛋白相對表達(dá)水平

討 論

膽綠素是血紅蛋白的代謝產(chǎn)物，它再經(jīng)還原酶催化生成膽紅素，膽綠素和代謝產(chǎn)物膽紅素都具有抗氧化作用。研究發(fā)現(xiàn)，同等條件下每分子膽綠素和膽紅素可以分別清除4.7和1.9分子氧自由基，膽綠素清除氧自由基的能力比膽紅素更有效，而且膽綠素可以同時清除1e?和2e?氧化劑，還可以與膜結(jié)合的α生育酚起到有效協(xié)同作用，抑制細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化［6］。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，30 mJ/cm2UVB照射后繼續(xù)培養(yǎng)24 h，HaCaT細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)成分縮減，邊緣銳利且細(xì)胞之間排列疏松。與對照組相比，UVB組細(xì)胞存活率明顯下降，而經(jīng)膽綠素預(yù)處理的HaCaT細(xì)胞組細(xì)胞存活率較UVB組明顯升高，且呈劑量相關(guān)性，說明膽綠素對UVB誘導(dǎo)的光損傷有一定保護(hù)作用。

MMP是皮膚光老化發(fā)生的一個關(guān)鍵酶，可導(dǎo)致皮膚皺紋產(chǎn)生和彈性降低。而皺紋形成與光損傷密切相關(guān)，抑制MMP產(chǎn)生就可以抑制皺紋的形成。所以抑制MMP產(chǎn)生已經(jīng)作為防止光損傷的重要策略，而減少M(fèi)MP產(chǎn)生的天然材料一樣可以防止光損傷［7］。本研究顯示，UVB照射可誘導(dǎo)MMP?1和MMP?3蛋白表達(dá)，加入一定濃度膽綠素預(yù)處理后，可以有效抑制MMP?1和MMP?3蛋白表達(dá)，進(jìn)一步證實膽綠素對UVB誘導(dǎo)的細(xì)胞光損傷有防護(hù)作用。

Nrf2是一種含有亮氨酸拉鏈基本結(jié)構(gòu)的核轉(zhuǎn)錄因子，通過編碼抗氧化性的保護(hù)蛋白調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)，并通過與抗氧化反應(yīng)元件（ARE）相互作用，構(gòu)成Nrf2/ARE通路——細(xì)胞抗氧化反應(yīng)的中樞調(diào)節(jié)［8］。當(dāng)外界氧化還原環(huán)境發(fā)生變化或通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)誘導(dǎo)后，可以激活這個通路，啟動下游靶基因，發(fā)揮抗氧化、抗炎癥、抗凋亡和維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等作用，Nrf2/ARE通路在許多與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)的疾病中發(fā)揮作用［9］。研究報道，Nrf2缺失或激活障礙，會增加細(xì)胞對UV照射的敏感性，Nrf2/ARE通路在細(xì)胞光損傷中發(fā)揮保護(hù)作用［10］。近年研究表明，UVB照射HaCaT細(xì)胞后Nrf2蛋白表達(dá)水平降低，應(yīng)用Nrf2活化劑可以有效激活Nrf2抗氧化應(yīng)激通路，參與并對抗氧化應(yīng)激［11］。本研究證實，UVB照射后HaCaT細(xì)胞中Nrf2蛋白表達(dá)降低，但加入一定濃度膽綠素預(yù)處理HaCaT細(xì)胞后，Nrf2蛋白表達(dá)升高，提示膽綠素可作為Nrf2因子的活化劑，通過誘導(dǎo)Nrf2基因和蛋白的表達(dá)拮抗UVB照射引起細(xì)胞光損傷，其機(jī)制可能與Nrf2抗氧化應(yīng)激通路相關(guān)。

綜上所述，UVB可以誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生光損傷，降低細(xì)胞存活率，外源性膽綠素可以有效提高細(xì)胞生存率，對細(xì)胞光損傷起到一定防護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與Nrf2抗氧化應(yīng)激通路有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

［1］Kammeyer A,Luiten RM.Oxidation events and skin aging［J］.Ageing Res Rev,2015,21:16?29.doi:10.1016/j.arr.2015.01.001.

［2］Watson RE,Gibbs NK,Griffiths CE,et al.Damage to skin extracellular matrix induced by UV exposure［J］.Antioxid Redox Signal,2014,21（7）:1063?1077.doi:10.1089/ars.2013.5653.

［3］Kosaka J,Morimatsu H,Takahashi T,et al.Effects of biliverdin administration on acute lung injury induced by hemorrhagic shock and resuscitation in rats［J/OL］.PLoS One,2013,8（5）:e63606.doi:10.1371/journal.pone.0063606.

［4］Jansen T,Hortmann M,Oelze M,et al.Conversion of biliverdin to bilirubin by biliverdin reductase contributes to endothelial cell protection by heme oxygenase?1?evidence for direct and indirect antioxidant actions of bilirubin［J］.J Mol Cell Cardiol,2010,49（2）:186?195.doi:10.1016/j.yjmcc.2010.04.011.

［5］Bai B,Liu Y,You Y,et al.Intraperitoneally administered bili?verdin protects against UVB ?induced skin photo?damage in hairless mice［J］.J Photochem Photobiol B,2015,144:35?41.doi:10.1016/j.jphotobiol.2015.02.001.

［6］MacLean PD,Chapman EE,Dobrowolski SL,et al.Pyrroles as antioxidants:solvent effects and the nature of the attacking radical on antioxidant activities and mechanisms of pyrroles,dipyrrinones,and bile pigments［J］.J Org Chem,2008,73（17）:6623?6635.doi:10.1021/jo8005073.

［7］Pallela R,Na?Young Y,Kim SK.Anti?photoaging and photo?protective compounds derived from marine organisms［J］.Mar Drugs,2010,8（4）:1189?1202.doi:10.3390/md8041189.

［8］Guo H,Zheng Y,Wang B,et al.A note on an improved self?healing group key distribution scheme［J］.Sensors（Basel）,2015,15（10）:25033?25038.doi:10.3390/s151025033.

［9］Muthusamy VR,Kannan S,Sadhaasivam K,et al.Acute exercise stress activates Nrf2/ARE signaling and promotes antioxidant mechanisms in the myocardium［J］.Free Radic Biol Med,2012,52（2）:366?376.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2011.10.440.

［10］Soeur J,Eilstein J,Léreaux G,et al.Skin resistance to oxidative stress induced by resveratrol:from Nrf2 activation to GSH biosynthesis［J］.Free Radic Biol Med,2015,78:213 ?223.doi:10.1016/j.freeradbiomed.2014.10.510.

［11］Kim M,Park YG,Lee HJ,et al.Youngiasides A and C isolated from youngia denticulatum inhibit UVB?induced MMP expression and promote type I Procollagen production via repression of MAPK/AP?1/NF?κB and activation of AMPK/Nrf2 in HaCaT cells and human dermal fibroblasts［J］.J Agric Food Chem,2015,63（22）:5428?5438.doi:10.1021/acs.jafc.5b00467.