成 丹，聶天驕，李成慧

（蘇州農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院，江蘇蘇州 215008）

鐵皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et M.go）蘭科石斛屬多年生附生草本植物，又名鐵皮蘭、黑節(jié)草，生于海拔達1600m的山地半陰濕的巖石上。其莖入藥，屬補益藥中的補陰藥，有滋陰益胃，清熱生津，有提高人體免疫功能、防治腫瘤和延年益壽等功效，被廣泛應用于臨床和日常生活保健[1]。被國家列為重點保護藥用植物。鐵皮石斛種子在自然條件下繁殖率極低，而又由于人們的過度開采，鐵皮石斛野生資源被采挖殆盡，已經(jīng)瀕臨滅絕，因此鐵皮石斛在市場上的價格居高不下，且在國內(nèi)市場無大規(guī)模的供應[2]。鐵皮石斛種苗組織培養(yǎng)技術快速繁殖已初具規(guī)模，但一次成苗技術鮮有報道。組織培養(yǎng)一次成苗技術即是用一種培養(yǎng)基完成種苗的整個生長過程，極大簡化了組織培養(yǎng)流程。在鐵皮石斛組織培養(yǎng)研究中多以種子為外植體[3]，但是鮮有以莖段為外植體的一次成苗技術的報道，且可適于外植體培養(yǎng)的種子很少，很難滿足市場需求。本研究旨在簡化育苗流程，降低成本，促進鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗所用的鐵皮石斛材料于2017年5月選自于江蘇省林科院。挑選健康、無病蟲害植株，以莖段作為外植體。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體的處理。選取長勢良好、均勻、葉片繁茂的鐵皮石斛材料，將其莖段從植株上剪下，去掉葉片后，剪取一定長度的帶節(jié)間莖段，將其放入搪瓷缸中，再將紗布蓋在搪瓷缸口，用流水沖洗20min。之后再將洗衣粉倒在搪瓷缸里，用玻璃棒攪拌均勻，浸泡30min。用流水沖洗干凈后，將材料用75%的酒精浸泡30s，無菌水沖洗1次，再用0.1%的升汞浸泡8min，用無菌水沖洗5～8次，材料滅菌后應立即取出，然后放在無菌紙上瀝干，留待接種。

1.2.2 一次成苗初代培養(yǎng)基的篩選?；九囵B(yǎng)基使用MS 和 1/2MS，分別添加 0.3mg/L、0.5mg/L、0.7mg/L 的NAA與1mg/L、3mg/L、5mg/L的6-BA，在此基礎上添加香蕉泥100g/L、蔗糖30g/L、瓊脂6.5g/L，pH值為5.8。將消毒好的鐵皮石斛莖段接種在上述不同處理的培養(yǎng)基中，每種處理接種外植體10瓶，每瓶接種5個莖段材料。將所有的組培苗放在光照強度為2000Lx，溫度為（25±2）℃的培養(yǎng)室里，35d后統(tǒng)計不定芽的誘導率。不定芽的誘導率（%）=誘導出芽苗數(shù)/未污染的接種數(shù)，統(tǒng)計并作好記錄，從而篩選出一次成苗的最適培養(yǎng)基。

2 結果

試驗結果表明，基本培養(yǎng)基為1/2MS的鐵皮石斛組培苗不定芽的誘導率普遍比基本培養(yǎng)基為MS的不定芽誘導率高，且長勢普遍良好，比基本培養(yǎng)基為MS的組培苗效果更加明顯，誘導的不定芽更多，更加壯實。在接種莖段后的5～15d內(nèi)，不同處理的鐵皮石斛組培苗都開始發(fā)芽，但是隨著時間的推移，在生長后期開始出現(xiàn)明顯差距，有的不定芽生長不明顯，有的不定芽生長慢，非常細弱?；九囵B(yǎng)基為1/2MS的鐵皮石斛組培苗明顯長勢普遍更佳，組培苗的不定芽數(shù)更多，不定芽長得更加健壯。

培養(yǎng)基中不同濃度的激素含量對組培苗的不定芽的生長誘導及促進有一定程度的差異。在植物組織培養(yǎng)中最常用的是生長素和細胞分裂素，本實驗選用了其中最具代表性的NAA和6-BA來進行研究。

當培養(yǎng)基中的激素NAA濃度在0.5mg/L時，鐵皮石斛組培苗不定芽生長的數(shù)量及其誘導率相比，NAA濃度為0.3mg/L以及0.7mg/L時更多更高，而且較其而言，當培養(yǎng)基中的NAA為0.5mg/L時其組培苗長勢更佳，不定芽長得更加壯實、健康、旺盛。但當NAA在0.3mg/L以及0.7mg/L時，不定芽的誘導率相比較而言較低，對組培苗不定芽的生長，不定芽的誘導有一定程度的抑制作用；當培養(yǎng)基中的6-BA為3mg/L時，鐵皮石斛組培苗的不定芽的誘導率比較高，不定芽生長的數(shù)量及其誘導率相比6-BA濃度為1mg/L以及5mg/L時更多更高，且培養(yǎng)基中的6-BA為3mg/L的石斛組培苗長勢相較更佳，當培養(yǎng)基中的6-BA濃度為1mg/L及5mg/L時，對鐵皮石斛組培苗的不定芽的誘導與生長起到一定程度的抑制作用，長勢也相較略差，不定芽長得比較緩慢，瘦弱。數(shù)據(jù)表明：隨著培養(yǎng)基中的激素NAA濃度的提高，激素6-BA對不定芽誘導與生長的影響呈現(xiàn)著先增大后減小的趨勢，這說明過高或過低濃度的6-BA對不定芽的增殖有著一定程度的抑制作用。從整體來看，培養(yǎng)基中的激素NAA對鐵皮石斛組培苗不定芽誘導與生長的影響隨著其濃度的增高而逐漸開始抑制。由此可見：選取合適的培養(yǎng)基激素濃度對組培苗不定芽的增殖有顯著的促進作用。

表1 不同的培養(yǎng)基對成苗的影響

總的數(shù)據(jù)統(tǒng)計表明：培養(yǎng)基中的NAA濃度在0.5mg/L以及其中的激素6-BA濃度為3mg/L時，鐵皮石斛的組培苗不定芽的誘導與生長情況為最佳狀態(tài)，這2種濃度的激素都極利于不定芽的生長。在培養(yǎng)基中加入的激素NAA濃度 為0.3mg/L、0.7mg/L以及培養(yǎng)基中的激素6-BA濃度為1mg/L、5mg/L時，組培苗的不定芽誘導率都相較較低而且不定芽的數(shù)量也很少，生長明顯緩慢，生長后期幾乎停止生長，且不定芽長得十分瘦弱，長勢不佳。因此，由此可得出鐵皮石斛一次成苗的最適培養(yǎng)基配方為：1/2MS+蔗糖30g/L+瓊脂6.5g/L+香蕉泥100g/L+NAA 0.5mg/L+6-BA 3mg/L，pH值為5.8，這一培養(yǎng)基最利于鐵皮石斛組培苗不定芽的誘導與生長。

3 討論

石斛一直被認為是中藥中的上品，已在臨床上及中藥復方中被廣泛應用。況且，鐵皮石斛的花朵外形優(yōu)美，花香怡人，廣受人們的喜愛并具有極高的觀賞價值，在國際花卉市場上占有重要的地位。但是由于人們對鐵皮石斛的過度開采，它的的野生生態(tài)壞境遭到嚴重破壞，野生資源正在大幅度減少，已瀕臨絕跡，但是與此同時，它的市場的需求量在逐年上升，鐵皮石斛材料短缺，作為瀕臨滅絕的受保護中藥品種之一[4]，市場售價較高。鐵皮石斛人工培養(yǎng)具有重大意義，現(xiàn)關于鐵皮石斛快繁體系研究頗多并有顯著成果，在市場上多已利用于規(guī)模生產(chǎn)，但在其組織培養(yǎng)繁殖[5]方面仍存在問題，并且關于以其莖段為外植體的一次成苗技術鮮有報道，其系統(tǒng)性也不夠，本研究主要在前人研究的基礎上，課題組成員多方查閱文獻資料，廣泛進行調查研究，對國內(nèi)外本項目領域的研究現(xiàn)狀進行分析，對鐵皮石斛一次成苗過程進行初步研究，以期能夠簡化鐵皮石斛組培種苗培育的流程，將其投入大規(guī)模的工廠生產(chǎn)可大大降低成本，縮短種苗的繁育時間，以期推動鐵皮石斛的產(chǎn)業(yè)化進程

（收稿：2018-01-11）

參考文獻：

[1]楊善巖,李海龍,狄志鴻.鐵皮石斛原球莖富鉻培養(yǎng)條件優(yōu)化[J].農(nóng)業(yè)科學與技術,2013,（12）:1702-1706

[2]宋順,許奕,王必尊,等.不同培養(yǎng)基成分對鐵皮石斛組織培養(yǎng)的影響[J].中國農(nóng)學通報,2013,29（13）:133-139．

[3]譙德惠.鐵皮石斛：藥用價值更勝一籌[J].中國花卉園藝,2014（5）:26-28

[4]楊冬華,羅冠勇,鐘云芳.鐵皮石斛組培苗生產(chǎn)流程及影響的因素分析[J].熱帶農(nóng)業(yè)工程,2013,37（3）:34-36

[5]蔣影,林昌虎,王文華,等.鐵皮石斛組培苗移栽馴化階段的生長動態(tài)研究[J].熱帶作物學報,2014,35（3）:483-487