潘 梅，符瑞侃，黃 賽，戚華莎，王景飛，呂德任(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶園藝研究所，海南 ?？?571100)

野生姜科植物土田七的外植體滅菌技術(shù)研究

潘 梅，符瑞侃，黃 賽*，戚華莎，王景飛，呂德任
(海南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 熱帶園藝研究所，海南 ?？?571100)

為篩選出土田七組織培養(yǎng)適宜的外植體類(lèi)型及其消毒方法，為土田七的無(wú)性繁殖提供技術(shù)支持，以土田七的莖尖、幼嫩葉片和根莖作為外植體，采用75%酒精和0.1%HgCl22種滅菌劑進(jìn)行消毒滅菌處理，研究了土田七組織培養(yǎng)中外植體的最佳滅菌方法。結(jié)果表明：莖尖的消毒相對(duì)容易，幼嫩葉片次之，根莖的消毒相對(duì)較難。莖尖采用75%酒精30 s+0.1%HgCl215 min的滅菌方法好；幼嫩葉片采用75%酒精10 s+0.1%HgCl25 min的滅菌方法好；根莖采用75%酒精30 s+0.1% HgCl230 min方法效果較好。

土田七；外植體；滅菌

土田七[Stahlianthusinvolucratus(King ex Baker.) Craib ex loesener]又稱(chēng)姜三七、姜田七，是姜目姜科土田七屬花卉，為多年生直立草本植物，分布于海南、廣東、廣西和福建[1]。土田七植株高20～30 cm，葉片披針形，花序從根莖抽出，10～15朵花聚生于鐘狀的總苞內(nèi)，花白色，唇瓣中央具杏黃色斑，花期5～7月，可作盆栽和花壇花卉，是極具開(kāi)發(fā)潛力的花卉資源。土田七可采用根莖繁殖，但繁殖系數(shù)低。利用組織培養(yǎng)技術(shù)建立土田七的快繁體系，則可以促進(jìn)土田七種苗的快速繁殖與應(yīng)用，目前尚無(wú)相關(guān)方面的報(bào)道。在植物組織培養(yǎng)過(guò)程中，無(wú)菌體系的建立是植物組織培養(yǎng)成功的關(guān)鍵，而外植體的選擇及其消毒方法是影響無(wú)菌體系建立的重要因素。由于外植體材料取自自然生長(zhǎng)的植株，帶有較多的細(xì)菌和真菌，需對(duì)其進(jìn)行消毒滅菌，要求既不損傷其組織材料保持生活力，使其在良好的培養(yǎng)條件下能正常生長(zhǎng)和繁殖，又要?dú)鐜в械母鞣N的微生物，只有篩選出成功的消毒方法，才能進(jìn)行進(jìn)一步的組織培養(yǎng)研究。本文以土田七的莖尖、幼嫩葉片的根莖作為外植體試材，對(duì)外植體類(lèi)型和滅菌時(shí)間等進(jìn)行研究，以期篩選出土田七組織培養(yǎng)適宜的外植體類(lèi)型及其消毒方法，為土田七人工組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)的建立提供一定的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

采自野外引種種于海南農(nóng)科院熱帶園藝研究所苗圃的植株，以土田七的莖尖、葉片和根莖作為外植體試材。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌體系的建立 采回的外植體先用流水洗去表面污物，再用洗潔精液清洗，最后用自來(lái)水沖洗。在無(wú)菌條件下使用75%酒精和0.1% HgCl22種滅菌劑，設(shè)計(jì)不同的滅菌劑與滅菌時(shí)間組合，進(jìn)行比較試驗(yàn)，分別篩選出適宜的組培外植體及3種不同外植體生長(zhǎng)的最佳滅菌方法。滅菌后的外植體均用無(wú)菌水沖洗5次備用。

1.2.2培養(yǎng)方法 將莖尖切成長(zhǎng)度為1.5 cm的小段，葉片切成1 cm見(jiàn)方的小塊，根莖切成長(zhǎng)約1 cm的小塊，接種于啟動(dòng)培養(yǎng)基MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L。培養(yǎng)基中均加入30 g/L食用蔗糖，8 g/L卡拉膠，pH 6.0。培養(yǎng)溫度(26±2) ℃，光照時(shí)間9 h/d，光照強(qiáng)度1 500 lx。

各處理接種50個(gè)外植體，培養(yǎng)25 d后分別統(tǒng)計(jì)污染率、死亡率、存活率和啟動(dòng)率。

污染率=污染的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

死亡率=死亡的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

存活率=存活外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)×100%；

啟動(dòng)率=存活外植體啟動(dòng)數(shù)/存活外植體數(shù)×100%；

芽誘導(dǎo)率=誘導(dǎo)出全部芽數(shù)/存活外植體數(shù)×100%。

2 結(jié)果與分析

2.1 莖尖滅菌的處理效果

莖尖接種培養(yǎng)到第6天時(shí)，處理A1和A2開(kāi)始出現(xiàn)污染；培養(yǎng)到第8天時(shí)，處理A3和A4也開(kāi)始出現(xiàn)污染；在培養(yǎng)10～12 d時(shí)，污染發(fā)生較為集中，有外植體出現(xiàn)褐化死亡現(xiàn)象，18 d后無(wú)污染再發(fā)生。從表1可以看出，隨著HgCl2消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，莖尖的污染率逐漸下降，死亡率則呈上升的趨勢(shì)。其中，消毒5 min時(shí)，莖尖沒(méi)有出現(xiàn)死亡，污染率最高，達(dá) 36%；消毒10 min時(shí)，莖尖死亡率只有2%，但污染率較消毒5 min的處理降低20%；消毒15 min時(shí)，污染率較低，為8%，但存活率則最高，達(dá)86%；消毒20 min時(shí)，死亡率增至16%，存活率降至78%。可見(jiàn)，0.1% HgCl2在 5～10 min內(nèi)對(duì)莖尖外植體傷害不大，但滅菌效果差，達(dá)到20 min時(shí)，雖然有良好的滅菌效果，但對(duì)外植體傷害較大。綜合污染率、死亡率和存活率3個(gè)指標(biāo)，莖尖的最佳消毒時(shí)間為HgCl2消毒15 min。

表1 莖尖的滅菌方法及效果

2.2 幼嫩葉片滅菌的處理效果

土田七的葉片對(duì)酒精較為敏感，在預(yù)試驗(yàn)中，用75%酒精處理30 s，葉片褐化明顯增多，以75%酒精處理10 s效果較好。葉片接種次日，處理B3～B4開(kāi)始出現(xiàn)褐化；培養(yǎng)到第3天時(shí)，各處理均開(kāi)始出現(xiàn)污染；第7天時(shí)，污染發(fā)生高峰；10天后，污染減少；20天后無(wú)污染再發(fā)生，污染多表現(xiàn)為霉菌污染。從表2可見(jiàn)，幼嫩葉片經(jīng)75%酒精和0.1% HgCl2滅菌處理后有不同程度的損傷，隨著0.1% HgCl2處理時(shí)間的延長(zhǎng)，葉片污染的幾率下降，但出現(xiàn)褐化死亡的幾率增加。0.1% HgCl24 min時(shí)，對(duì)葉片的傷害小，葉片死亡率最低，為 6%，但污染率高達(dá)到30%；0.1% HgCl28～10 min時(shí)，表現(xiàn)出很好的抑菌效果，污染率最低，僅有2%～6%，但給葉片造成的傷害大，死亡率達(dá)到28%～38%；0.1% HgCl26 min，葉片污染率較低，但成活率最高，達(dá)到76%。因此，葉片最佳的處理方法為0.1% HgCl26 min，即能有效控制菌類(lèi)的生長(zhǎng)，又保證了葉片的正常生長(zhǎng)。

表2 葉片的滅菌方法及效果

2.3 根莖滅菌的處理效果

相對(duì)于莖尖和葉片，土田七的根莖外植體滅菌較難，滅菌消毒所需時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。根莖接種后第3天開(kāi)始出現(xiàn)污染，第7天的污染數(shù)量最多。從表3可見(jiàn)，根莖的污染率較莖尖和葉片外植體高很多，最低為30%，最高達(dá)到92%，原因可能是由于根莖生長(zhǎng)在地下土壤中，帶有的雜菌較多，而且表面不太光滑，影響滅菌效果。根莖與莖尖和葉片外植體對(duì)消毒劑的反應(yīng)一致，隨著0.1% HgCl2處理時(shí)間的延長(zhǎng)，污染的幾率下降，0.1% HgCl235 min處理的根莖污染率最低，為30%。同時(shí)根莖外植體對(duì)消毒劑的耐受能力強(qiáng)于莖尖和葉片，0.1%HgCl210～25 min時(shí)，無(wú)外植體死亡；0.1% HgCl230 min時(shí)，個(gè)別外植體于第5天開(kāi)始變褐，約14 d軟化腐爛，死亡率4%；當(dāng)0.1% HgCl2消毒時(shí)間增加至35 min時(shí)，死亡率為14%，這可能是由于根莖外植體體積較大，不易對(duì)細(xì)胞組織造成傷害。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，6種處理中以C5和C6有較好的滅菌效果，其污染率低，二者數(shù)值較為接近，但C6的死亡率較高，比C5高了10%，存活率則下降了6%，因此，處理C5即0.1% HgCl230 min應(yīng)是根莖外植體適宜的滅菌方法。

表3 根莖的滅菌方法及效果

2.4 不同外植體的啟動(dòng)效果

莖尖接種次日出現(xiàn)抽長(zhǎng)，培養(yǎng)12 d，芽高達(dá)到2cm；培養(yǎng)15 d，基部開(kāi)始出現(xiàn)新芽；30 d時(shí)，成活外植體可有1～3個(gè)芽(圖l：A)。葉片以葉背接入培養(yǎng)基，培養(yǎng)18 d葉片中部向上拱起卷曲，有個(gè)別外植體褐化，之后死亡；培養(yǎng)40 d，個(gè)別外植體開(kāi)始出現(xiàn)愈傷組織(圖l：B)。根莖培養(yǎng)16 d開(kāi)始萌芽1～3個(gè)；30 d時(shí)，芽最高1.2cm(圖l：C)。從表4看出，在同樣的培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)條件下，莖尖的芽誘導(dǎo)率最高，達(dá)到191%；其次為根莖外植體，芽誘導(dǎo)率為167%；葉片的誘導(dǎo)率則為0；可見(jiàn)，土田七的組織培養(yǎng)外植體材料以莖尖為最佳，可以快速建立無(wú)菌體系。

表4 不同外植體的啟動(dòng)效果

圖1 土田七不同外植體消毒后的生長(zhǎng)情況(30 d)

3 結(jié)論與討論

外植體的消毒和選擇是無(wú)菌外植體建立的關(guān)鍵，是植物組織培養(yǎng)成功的最基本的重要前提和根本保證。不同的消毒方法、不同外植體類(lèi)型對(duì)植物組織培養(yǎng)的影響不同，應(yīng)根據(jù)滅菌外植體污染少、存活率高、易啟動(dòng)原則選取最佳外植體和消毒方法[2]。

不同的外植體對(duì)消毒藥劑的需求不同。一般情況下，消毒藥劑濃度太低，時(shí)間太短，不利于污染的控制；消毒藥劑濃度太高，時(shí)間太長(zhǎng)，會(huì)破壞外植體的細(xì)胞，由于細(xì)胞對(duì)自身的保護(hù)，細(xì)胞就不斷地產(chǎn)生大量次生物質(zhì)，從而引起細(xì)胞毒害，產(chǎn)生褐化甚至死亡，導(dǎo)致外植體的存活率下降[3]。外植體消毒能成功地降低污染，但由于消毒劑的穿透力和殺傷力也會(huì)對(duì)外植體造成損傷，影響外植體的再生及誘導(dǎo)愈傷組織[4]。在本實(shí)驗(yàn)中，土田七莖尖采用75%酒精30 s，0.1% HgCl2消毒15 min消毒效果最佳；葉片采用75%酒精10 s，0.1% HgCl2消毒6 min消毒效果最佳；根莖采用75%酒精30 s，0.1% HgCl2消毒30 min，基本上能達(dá)到較好的消毒效果。土田七3種外植體對(duì)消毒藥劑的表現(xiàn)出不同的需求，可能的原因是：莖尖外植體有葉鞘包裹，感染雜菌的幾率低受雜菌的污染較少，加之剝除葉鞘后的莖尖外表較光滑，因此較易消毒，污染率低；而外表的包片保護(hù)著莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)不直接受到消毒劑的傷害，故死亡率也較低。葉片生長(zhǎng)于地面，帶菌較少且表面光滑，較容易消毒，故消毒時(shí)間短，污染率也相對(duì)小。但葉片組織較薄，易受到消毒劑的傷害，從而引起細(xì)胞毒害，產(chǎn)生褐化甚至死亡，導(dǎo)致外植體的存活率下降。根莖生長(zhǎng)在地下土壤中，帶有的雜菌較多，而且表面不太光滑，故滅菌效果較差。然而，根莖外植體體積較大，不易對(duì)細(xì)胞組織造成傷害，故對(duì)消毒劑的耐受能力強(qiáng)。因此，外植體消毒時(shí)，要掌握好各個(gè)指標(biāo)的平衡關(guān)系，盡量減少因消毒產(chǎn)生的對(duì)外植體的傷害，以免使外植體消毒后在培養(yǎng)過(guò)程中啟動(dòng)慢，或者不啟動(dòng)[5]。

植物種類(lèi)不同，其無(wú)性繁殖的能力也不一樣，同一種植物不同的組織和器官其再生能力也有很大的差異[6]。采用篩選出的最佳消毒方式，在相同培養(yǎng)條件下，土田七不同類(lèi)型的外植體芽誘導(dǎo)率不同。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，土田七莖尖材料的芽發(fā)生時(shí)間最早，芽誘導(dǎo)率明顯高于根莖材料；葉片材料在培養(yǎng)40天后才有少量的外植體產(chǎn)生愈傷組織。3種外植體雖然攜帶著土田七相同的全套基因，但其組織培養(yǎng)結(jié)果不一樣，這可能是與植物激素的分布有關(guān)，因植物體內(nèi)內(nèi)源激素分布不均，導(dǎo)致了基因表達(dá)不一致[3]。葉片培養(yǎng)需要較長(zhǎng)的時(shí)間，愈傷組織萌動(dòng)晚，而且葉片誘導(dǎo)的愈傷組織還需要較長(zhǎng)的增殖分化時(shí)間，故葉片作為土田七組培外植體材料并不理想。根莖作為外植體，消毒時(shí)間長(zhǎng)，污染率高，且芽發(fā)生較晚。莖尖作為外植體，無(wú)需經(jīng)過(guò)愈傷組織可以直接獲得芽，發(fā)生時(shí)間短，且誘導(dǎo)的芽數(shù)多，因此更容易滿足短時(shí)間大量增殖組培苗和獲得優(yōu)質(zhì)組培苗的目的。因此，土田七的組織培養(yǎng)外植體材料以莖尖為最佳。

本試驗(yàn)通過(guò)研究篩選出土田七組織培養(yǎng)適宜的外植體及其滅菌方法，為土田七組培快繁技術(shù)的建立打下了基礎(chǔ)，對(duì)今后土田七的工廠化育苗以及資源的保持和可持續(xù)利用有著重要的意義。

[1] 高江云，夏永梅，黃加元，等. 中國(guó)姜科花卉[M]. 北京：科學(xué)技術(shù)出版社，2006：107.

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Study on Sterilization Technology of Explant of Wild Zingiberaceac PlantStahlianthusinvolucratus

Pan Mei，F(xiàn)u Ruikan，Huang Sai，Qi Huasha﹡，Wang Jingfei，Lü Deren
(Tropical Horticulture Research Institute of Hainan Academy of Agricultural Sciences，Haikou 571100，China)

In order to select appropriate explants type and disinfection methods ofStahlianthusinvolucratusin tissue culture and provide technical support for its asexual propagation，the stem tip，spire and rootstock were used as the explants. The best sterilization method of the explants were studied by using 75% alcohol and 0.1% HgCl2. The results showed that the disinfection of stem tip was relatively easy，followed by the spire，the rootstock was more difficult. Sterilizing the stem tip with 75% alcohol 30 s+ 0.1% HgCl215 min and sterilizing the spire with 75% alcohol 10 s+ 0.1% HgCl25 min were good and sterilizing the rootstock with 75% alcohol 30 s+ 0.1% HgCl230 min was better.

Stahlianthusinvolucratus；explant；sterilization

10.3969/j.issn.1006-9690.2017.03.006

2016-10-18

海南省科研院所技術(shù)開(kāi)發(fā)研究專(zhuān)項(xiàng)—海南姜科花卉植物收集與離體繁殖技術(shù)研究(KYYS-2015-14)。

潘梅(1962—)，女，高級(jí)園藝師，研究方向：植物組織培養(yǎng)研究與開(kāi)發(fā)利用。E-mail：panmei200@sina.com

*通訊作者： 黃賽(1975—)，女，園藝師，研究方向：植物組織培養(yǎng)研究與開(kāi)發(fā)利用。E-mail：huangsai512@163.com

S685；Q813.1

A

1006-9690(2017)03-0023-04