裴宸晨，李 樂

（1.浙江工業(yè)大學藥學院藥劑14級，2.浙江工業(yè)大學藥學院藥理研究所，杭州310014）

心肌纖維化（myocardial fibrosis，MF）是心臟成纖維細胞數(shù)量增加，心肌間質(zhì)膠原過度沉積所致。MF破壞心臟功能，可促發(fā)充血性心力衰竭、惡性心律失常和猝死。MF常繼發(fā)于冠心病、高血壓等心血管疾病，也是心室重構(gòu)發(fā)展難以逆轉(zhuǎn)的重要原因，因此預防及控制MF具有重要的臨床意義［1］。

傳統(tǒng)中藥貝母能清熱止咳化痰?，F(xiàn)代研究證明其在抗炎、抗腫瘤、降血壓、抗氧化等方面藥理活性強，尤其抗炎方面［2］。貝母在抗炎，抗氧化等方面效果顯著，由此推測其可能對MF具有防治作用。為此本實驗觀察貝母提取物（fritillaria extract，F(xiàn)E）對小鼠MF的影響，探討其治療異丙腎上腺素（isoproterenol，Iso）誘導MF作用及其可能機制，此類實驗國內(nèi)外尚未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康昆明種小鼠，18～22 g，雌雄兼用，浙江省實驗動物中心提供，合格證號：SCXK（浙）20160013；光照 12 h，明暗交替，正常飲食飲水，實驗處置符合動物倫理學標準。

1.2 藥品、試劑及主要儀器

FE，浙江省湖州生物技術(shù)公司，生料比10∶1；Iso，上海禾豐制藥有限公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒，南京建成生物公司；山羊抗鼠TGF-β1多克隆抗體、辣根酶標記兔抗羊IgG抗體，武漢博士德生物技術(shù)公司；倒置顯微鏡XDS-1B型，重慶光學儀器廠；Synergy H1多功能酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；80-2型低速離心機，上海醫(yī)療器械集團公司。

1.3 小鼠MF模型復制及實驗分組、給藥

昆明種小鼠40只，隨機均分為對照組、Iso模型組、Iso+FE 300 mg／kg組、Iso+FE 900 mg／kg組（n＝10）。除對照組外，其余各組每只小鼠 i.h Iso 1.5 mg／kg（0.3 ml／d），連續(xù) 14 d，對照組s.c等量生理鹽水；同時，Iso+FE低、高劑量組分別0.4 ml／d，0.9 ml／d灌胃 FE，連續(xù) 30 d，而對照組和 Iso模型組以等量生理鹽水灌胃。

1.4 心重指數(shù)測定

實驗結(jié)束后，小鼠稱重，眼球取血，3 000 r／min，離心 10 min，取上清液用于SOD，MDA測定；處死小鼠取心臟，稱重，計算心重指數(shù)（heart weight／body weight，HW／BW）。

1.5 生化指標檢測

1.6 左心室組織病理學檢查

每組取10只小鼠心尖組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋制成5μm切片，分別進行HE及Masson染色，顯微鏡觀察下心肌組織學的改變。

取上清液，按照試劑盒說明書嚴格操作，測定SOD活性及MDA含量。

1.7 免疫組化法檢測小鼠心肌組織TGF-β1蛋白表達

取小鼠左心肌組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片。然后脫蠟、水化，3%H2O2室溫封閉10 min，羊血清封閉液室溫封閉30 min。滴加各種1抗（TGF-β1），4℃濕盒過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后滴加1∶100辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgGⅡ抗，室溫孵育30 min，PBS清洗后滴加辣根過氧化物酶，DAB顯微鏡下控制顯色，蘇木素復染。顯微鏡觀察細胞質(zhì)中棕黃色顆粒（TGF-β1陽性）、攝像，Quantity One分析軟件測定陽性顆粒光密度值。

1.8 統(tǒng)計學分析：

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）來表示，多組間數(shù)據(jù)用One-way ANOVA方法分析，兩組間比較采用 t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 心重指數(shù)的變化

與對照組相比，Iso模型組小鼠心重指數(shù)明顯增加（P＜0.01）；經(jīng)FE治療后，與Iso模型組相比，F(xiàn)E高、低劑量組心重指數(shù)明顯降低（P＜0.05，P＜0.01，表 1）。

2.2 小鼠血清SOD活性、MDA含量

與Iso模型組比較，Iso FE治療組小鼠血清SOD活性明顯升高（P＜0.05），而 MDA含量顯著降低（P＜0.05，表 2）。

Tab.1 Changes of heart weight index of mice（±s，n＝10）

Tab.1 Changes of heart weight index of mice（±s，n＝10）

FE：Fritillaria extract；Iso：Isoproterenol；HW：Heart weight；BW：Body weight*P＜0.01 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs iso model group

Group Dose（mg／kg） BW（g） HW（mg） HW／BW（mg／g ）Control - 26.12±3.34 114.36±16.06 3.73±0.46 Iso model - 23.60±7.79 112.67±34.30 4.85±0.50**Iso+FE 300 31.80±2.17 143.97±9.01 4.54±0.37#Iso+FE 900 28.03±2.90 117.06±10.60 4.14±0.31##

Tab.2 Levels of SODand MDA in serum of mice（±s，n＝10）

Tab.2 Levels of SODand MDA in serum of mice（±s，n＝10）

FE：Fritillariaextract；SOD：Superoxide dismutase；MDA：Malondialdehyde*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs Isomodel group

Group Dose（mg／kg） SOD（U／ml） MDA（nmol／ml ）Control - 49.54±6.86 289.41±83.43 Iso model - 41.42±11.12*321.18±31.09*Iso+FE 300 45.16±2.27#298.38±41.04#Iso+FEt 900 55.25±7.58##293.93±31.28##

2.3 左心室組織病理學變化

對照組心肌組織排列整齊，間隙正常；Iso模型組細胞間隙增加，炎性細胞浸潤，形態(tài)不規(guī)整，胞核深染；比較Iso模型組，F(xiàn)E給藥組炎性浸潤程度均不同程度下降，胞間間隙減小，壞死或膨大細胞減少（圖1，見彩圖頁Ⅱ）。

Fig.1 Changes of cardial tissues in eacy group（HE ×100）

Masson染色顯示心肌組織膠原纖維呈藍綠色，心肌纖維呈紅色。對照組心肌細胞形態(tài)正常，纖維排列致密整齊，模型組有大量膠原纖維沉積并向鄰近肌束延伸，Iso+FE治療組雖仍有膠原沉積，但較Iso模型組膠原沉積顯著減少，炎癥明顯減輕（圖2，見彩圖頁Ⅱ）。

Fig. 2 Pathology changes of cardial tissues in each group mice（Masson ×200）

2.4 免疫組化法檢測TGF-β1表達的變化

Iso模型組棕褐色顆粒TGF-β1表達明顯高于對照組，呈強陽性反應。與對照組相比，F(xiàn)E低劑量治療組TGF-β1蛋白表達水平仍較高，但與Iso模型組相比降低。而高劑量FE組TGF-β1蛋白表達則顯著減少（圖3，見彩圖頁Ⅱ）。

Fig. 3 Expression of TGF-β1 on cardial tissues of each group（Immunohistochemistry ×100）

3 討論

MF主要以心肌纖維細胞異常增殖與細胞外基質(zhì)（ECM）大量沉積為重要特點的病理改變，是多種心血管疾病共同的病理基礎(chǔ)；目前臨床多用β腎上腺素受體阻斷劑，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等對抗，療效不佳且難以持久用藥［3］。

本研究顯示，應用Iso造模后，F(xiàn)E高劑量組心重指數(shù)，與Iso模型組比較明顯減小，表明FE能有效地抑制模型小鼠的心肌肥厚。

本實驗證實FE對Iso所致MF小鼠的心肌細胞纖維化程度、炎性浸潤水平均有改善，且升高血清 SOD活性，降低MDA含量。推測FE可能通過清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，對心肌肥厚及MF起到保護作用。

大量研究顯示，在心肌損傷時，成纖維細胞被激活增殖為肌成纖維細胞，TGF-β1等活性分子促進MF，刺激成纖維細胞活化，上調(diào)I、III型膠原合成并抑制膠原酶釋放，調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)，增加纖維蛋白膠原和蛋白聚糖，抑制細胞外基質(zhì)降解；通過下游Smad信號通路調(diào)節(jié)纖維化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄［4］；同時，TGF-β1介導 RAAS活化 Ang II升高誘導的 MF［5］。本實驗提示FE可以抑制Iso誘發(fā)的心肌組織成纖維細胞活化，下調(diào) TGF-β1蛋白表達。

綜上所述，本實驗證實，F(xiàn)E能有效對抗Iso誘發(fā)的MF，降低Iso造成的血清SOD活性降低，升高MDA含量。其抗MF機制與FE清除氧自由基，減輕脂質(zhì)過氧化損傷，抑制TGF-β1表達有關(guān)，其深層機制待進一步研究。

【參考文獻】

［1］ Broberg CS，Burchill LJ.Myocardial factor revisited：The importance of myocardial fibrosis in adults with congenital heart disease［J］.Int J Cardiol，2015，189：204-210.

［2］ Yu Q，Zhang Y.Transforming growth factor-β1 mediates NADPH oxidase 4：A significant contributor to the pathogenesis of myocardial fibrosis［J］.Int J Cardiol，2017，227：53-54.

［3］ Gao X，He X，Luo B，et al.Angiotensin II increases collagen I expression via transforming growth factor-beta1 and extracellular signal-regulated kinase in cardiac fibroblasts［J］.Eur J Pharmacol，2009，606（1-3）：115-120.

［4］ 張冠軍，張蔚屏，王開成，等.厄貝沙坦對抗糖尿病大鼠心肌纖維化作用及機制［J］.中國應用生理學雜志，2016，32（3）：220-224.

［5］ Li Y，Yang Y，Yu D，et al.The effect of tanshinone IIA upon the TGF-beta1／Smads signalingpathway in hypertrophicmyocardium of hypertensive rats［J］.JHuazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2009，29（4）：476-480.