鄧炳楠，孫景然，金 宏，聶鴻靖，段瑞峰，劉 列，高志賢，陳照立

（軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所，天津300050）

大豆異黃酮（soybean isoflavones，SI）是一種大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的次生代謝物，屬于生物類黃酮，僅存在于豆科植物中，具有預(yù)防腫瘤、抗心腦血管疾病、預(yù)防老年性疾病、免疫調(diào)節(jié)、抗自由基損傷等生理特性而引起廣泛關(guān)注［1，2］。在運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，隨著運(yùn)動(dòng)時(shí)間的延長(zhǎng)和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度的增大，機(jī)體內(nèi)環(huán)境也會(huì)隨之發(fā)生變化，伴隨肌肉收縮和舒張，能量不斷被消耗，同時(shí)能源物質(zhì)和代謝模式也會(huì)發(fā)生改變，包括機(jī)體代謝中間產(chǎn)物等都可能出現(xiàn)較大變化［3，4］。目前SI作為抗疲勞劑的研究結(jié)果尚不一致，能否作為新的抗疲勞營(yíng)養(yǎng)物引入尚未定論。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究SI對(duì)負(fù)重游泳小鼠的作用，檢測(cè)其對(duì)小鼠乳酸（lactic acid，Lac）、乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）、肌酸激酶（creatine kinase，CK）、琥珀酸脫氫酶（succinate dehydrogenase，SDH）、ATP酶活性等的影響，為抗疲勞產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明雄性小鼠，動(dòng)物批號(hào)scxk-（軍）-2009-003，體質(zhì)量18～22 g，由軍事醫(yī)學(xué)研究院環(huán)境醫(yī)學(xué)與作業(yè)醫(yī)學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 試劑

Lac試劑盒、血清 LDH、CK、SDH、ATPase酶等試劑盒（南京建成生物工程研究所提供）。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

游泳箱（70 cm×50 cm×40 cm），uQuantTM超級(jí)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek公司），Eppendorf-5417R高速冷凍離心機(jī)（德國(guó) eppendorf公司），HH·W21·420型水浴鍋。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)采用雄性昆明小鼠30只，根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分為3組（n＝10）：正常組、游泳模型組、SI組。正常組和模型組喂AIN-93M合成飼料［5］，SI組在AIN-93M合成飼料中添加0.4%的SI，3組小鼠均自由飲水?dāng)z食。飼養(yǎng)2周，模型組和SI組每周進(jìn)行1次游泳鍛煉，每次10 min。實(shí)驗(yàn)第15天，小鼠負(fù)重2%游泳1 h（水溫35℃，水深30 cm）后處死全部小鼠，取血清、肝臟、骨骼肌，分別測(cè)定Lac含量（血清）、LDH（血清和骨骼?。?、SDH（肝臟和骨骼?。?、ATPase酶（肝臟和骨骼?。K（血清和肌肉）活性。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用方差分析進(jìn)行組間檢驗(yàn)，然后進(jìn)行兩兩比較，分析數(shù)據(jù)差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 小鼠體質(zhì)量變化

飼料中添加SI后，經(jīng)過(guò)2周的飼養(yǎng)，各組小鼠體質(zhì)量無(wú)顯著性差異，生長(zhǎng)良好，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所采用SI的劑量對(duì)小鼠的生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響（表1）。

Tab.1 Body weight changes after two weeks of the experiment（g，±s，n＝10）

Tab.1 Body weight changes after two weeks of the experiment（g，±s，n＝10）

SI：Soybean isoflavones

Group Before After Nomal control 26.7±2.1 37.3±2.5 Model 26.8±1.4 38.5±3.1 SI 26.3±1.4 38.3±2.8

2.2 SI對(duì) Lac、LDH的影響

小鼠游泳后，血清中Lac含量明顯提高，補(bǔ)充SI后，雖然較正常水平仍有顯著提高，但與游泳模型組相比，已有明顯的下降；經(jīng)過(guò)負(fù)重游泳的劇烈運(yùn)動(dòng)后，與正常組小鼠相比，模型組小鼠血清LDH活性有所升高，SI組小鼠血清中LDH活性則顯著升高（P＜0.01）；與正常組相比，運(yùn)動(dòng)后模型組和 SI組骨骼肌中LDH活性都有明顯升高（P＜0.05），并且補(bǔ)充SI組較模型組也有顯著升高（P＜0.05，表2）。

2.3 SI對(duì)CK和SDH活性的影響

經(jīng)過(guò)負(fù)重游泳的劇烈運(yùn)動(dòng)后，與正常組小鼠相比，模型組和SI組小鼠血清中CK活性都有明顯升高（P＜0.05），并且補(bǔ)充SI組較模型組也有顯著升高（P＜0.05）；骨骼肌CK水平變化趨勢(shì)與血清基本一致，運(yùn)動(dòng)后模型組和SI組骨骼肌CK活性較正常組都有明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），并且補(bǔ)充 SI組較模型組也有顯著升高（P＜0.05）；SDH活性變化與CK相似，模型組肝臟中SDH活性顯著性降低（P＜0.05），補(bǔ)充 SI組則較模型組顯著升高（P＜0.05），基本恢復(fù)正常值水平；運(yùn)動(dòng)后模型組和SI組小鼠骨骼肌SDH活性較正常組均有顯著性升高（P＜0.05），且補(bǔ)充 SI組升高更為明顯（表 3）。

2.4 SI對(duì)ATP酶活性的影響

經(jīng)過(guò)負(fù)重游泳的劇烈運(yùn)動(dòng)后，與正常組小鼠相比，運(yùn)動(dòng)組小鼠肝臟組織中ATP酶活性變化不明顯，骨骼肌中兩種ATP酶活性均顯著降低（P＜0.05），補(bǔ)充SI組較模型組Na+K+-ATP酶和Ca2+Mg2+-ATP酶活性都有所升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（表4）。

Tab.2 Effects of SI on the content of Lac and LDH（±s，n＝10）

Tab.2 Effects of SI on the content of Lac and LDH（±s，n＝10）

SI：Soybean isoflavones；Lac：lactic acid；LDH：Lactate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs model group

Group Lac（mg／100 ml ）LDH Serum（U／L） Muscle（U／g·prot ）Normal control 11.60±0.89 13576.6±2660.2 5563.1±731.6 Model 18.29±1.59* 14021.2±1999.1 6239.4±605.8*SI 14.83±0.97*# 16934.3±1679.4**## 7034.2±859.1*#

Tab.3 Effects of SI on the activities of CK and SDH（±s，n＝10）

Tab.3 Effects of SI on the activities of CK and SDH（±s，n＝10）

SI：Soybean isoflavones；CK：Creatine kinase；SDH：Succinate dehydrogenase*P＜0.05，**P＜0.01 vs normal control group；#P＜0.05 vs model group

Group SDH（U／mg·prot ）Liver Muscle Normal control 0.61±0.07 0.88±0.15 9.86±1.17 8.07±1.14 Model 0.87±0.15* 1.06±0.16* 8.72±0.96* 9.38±1.16*SI 1.01±0.13**# 1.27±0.27**# 9.84±1.04# 9.63±1.16 CK Serum（U／ml） Muscle（U／g·prot ）*

Tab.4 Effects of SI on the activities of ATPase（μmolP／mg·pro·thr，±s，n＝10））

Tab.4 Effects of SI on the activities of ATPase（μmolP／mg·pro·thr，±s，n＝10））

SI：Soybean isoflavones*P＜0.05 vs normal control group

Group Ca2+Mg2+Ca2+Mg2+-ATPase Normal control 4.15±0.37 4.05±0.20 6.35±0.50 6.59±0.58 Model 3.80±0.27 3.72±0.19 4.62±0.32* 5.46±0.38*SI 3.88±0.32 3.78±0.26 5.02±0.23* 5.80±0.31 Liver Na+K+-ATPase -ATPase Muscle Na+K+-ATPase*

3 討論

SI是大豆生長(zhǎng)過(guò)程中形成的一種次生代謝產(chǎn)物，是一種植物雌激素，具有多種生理功能和保健功效［6，7］。從小鼠的體重增長(zhǎng)和發(fā)育情況來(lái)看，飼料中添加0.4%的SI對(duì)雄性昆明小鼠是安全劑量，對(duì)其生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)不良影響；根據(jù)前期的小鼠力竭游泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果，飼料中添加0.4%SI劑量對(duì)延長(zhǎng)小鼠的游泳力竭時(shí)間效果較好，能明顯提高小鼠的耐力。因此本實(shí)驗(yàn)把0.4%作為飼料中SI的添加劑量。

運(yùn)動(dòng)性疲勞是一種極其復(fù)雜的生理現(xiàn)象，其原因眾說(shuō)紛紜。專家學(xué)者們提出了很多假設(shè)來(lái)解釋疲勞現(xiàn)象及其成因，也曾成功的解釋了疲勞某一方面現(xiàn)象，但由于疲勞代謝過(guò)程及調(diào)節(jié)機(jī)制的復(fù)雜性，目前各種學(xué)說(shuō)又都具有一定的片面性或局限性，往往難以從整體闡釋疲勞過(guò)程的機(jī)制［8］。

目前運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)與生化指標(biāo)檢測(cè)相結(jié)合是評(píng)價(jià)疲勞較常用的方法［9］。本實(shí)驗(yàn)采用小鼠負(fù)重游泳的方法，檢測(cè)其代謝變化。疲勞產(chǎn)生的生化標(biāo)志物從代謝角度看有3類［10］：能源物質(zhì)如肝糖原、肌糖原；調(diào)節(jié)物質(zhì)，如激素；代謝產(chǎn)物如血Lac、血清尿素氮等，小鼠游泳力竭時(shí)間和生化指標(biāo)的變化，可以反映小鼠的疲勞程度和SI抗疲勞作用效果，因此本實(shí)驗(yàn)選取 Lac、LDH、CK、SDH、ATP酶等指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

Lac含量是反映機(jī)體疲勞程度的一個(gè)重要生理指標(biāo)［11］。一般認(rèn)為：機(jī)體經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的運(yùn)動(dòng)，Lac在體內(nèi)堆積，是造成疲勞的一個(gè)重要原因。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出：與正常組相比，模型組和SI組血清Lac都有顯著性升高，說(shuō)明進(jìn)行負(fù)重游泳運(yùn)動(dòng)后，小鼠的體能已有較大的消耗，無(wú)氧代謝途徑已成為游泳小鼠能量的重要補(bǔ)充，代謝產(chǎn)生較多的Lac，造成Lac堆積；與模型組相比，SI組血清Lac含量有明顯下降，說(shuō)明補(bǔ)充 SI后，能減少 Lac的堆積，或促進(jìn)Lac的消除，起到抗疲勞的作用。

運(yùn)動(dòng)過(guò)程中機(jī)體能量代謝大多都要經(jīng)過(guò)氧化磷酸化途徑，且氧化磷酸化過(guò)程都是在線粒體中進(jìn)行的，SDH是呼吸鏈中氧化還原酶復(fù)合體的組成成分之一，提高SDH的活性，有利于細(xì)胞內(nèi)ATP的生成。CK是一個(gè)與細(xì)胞內(nèi)能量運(yùn)轉(zhuǎn)、肌肉收縮、ATP再生有直接關(guān)系的重要激酶，它可逆地催化肌酸與ATP之間的轉(zhuǎn)磷?；磻?yīng)［12-14］；文獻(xiàn)報(bào)道：持續(xù)劇烈的運(yùn)動(dòng)過(guò)程會(huì)造成骨骼肌能量代謝途徑的保護(hù)性抑制，這可以從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)中得到印證。經(jīng)過(guò)1 h的負(fù)重游泳后，模型組小鼠骨骼肌中ATP酶活性顯著降低，說(shuō)明運(yùn)動(dòng)過(guò)程中骨骼肌能量代謝途徑可能受到一定抑制；SI組小鼠ATP酶活性較模型組有升高的趨勢(shì)，這對(duì)于加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)過(guò)程的能量供應(yīng)是十分有利的，有利于運(yùn)動(dòng)過(guò)程的持續(xù)進(jìn)行［13］。另外，SDH作為線粒體完整性和數(shù)量多少的標(biāo)志酶，其活性的變化常常伴隨線粒體的損傷及線粒體的數(shù)目改變［15-17］。小鼠運(yùn)動(dòng)后肝臟組織中SDH活性有所下降，說(shuō)明小鼠的能量代謝通路可能受到一定程度的影響；補(bǔ)充SI后SDH活性與正常組已無(wú)明顯差異，這些變化有利于及時(shí)恢復(fù)體能、解除疲勞，發(fā)揮肝臟能量代謝的正常生理功能；運(yùn)動(dòng)后骨骼肌組織中SDH活性顯著增高，有利于加強(qiáng)對(duì)機(jī)體的能量供應(yīng)，滿足機(jī)體運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的能量需求。游泳運(yùn)動(dòng)后，小鼠血清和骨骼肌中LDH與CK變化規(guī)律基本一致，說(shuō)明劇烈運(yùn)動(dòng)后，機(jī)體能量代謝明顯加強(qiáng)，與之相關(guān)的各種代謝酶的活性也隨之加強(qiáng)，尤其是補(bǔ)充SI組變化更為明顯，骨骼肌中LDH水平升高可能與機(jī)體的骨骼肌分解乳酸，減少Lac在骨骼肌積累作用的能力有關(guān)，推遲肌細(xì)胞中pH的下降時(shí)間，同時(shí)CK活性的提高，可能有利于減少機(jī)體的糖元的動(dòng)用，從而減少Lac的堆積，提高運(yùn)動(dòng)耐力，延緩了小鼠運(yùn)動(dòng)疲勞的發(fā)生［12，13］。

綜上所述，SI對(duì)游泳小鼠能量代謝有一定的調(diào)節(jié)作用，主要可能是通過(guò)提高LDH活性，減少Lac的堆積，提高SDH、CK等酶的活性，改善三羧酸循環(huán)，增加運(yùn)動(dòng)過(guò)程中的能量輸出，滿足小鼠運(yùn)動(dòng)的能量消耗，發(fā)揮抗疲勞的作用。通過(guò)進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，SI或許可以作為一種食品添加劑，開(kāi)發(fā)出一種新型的抗疲勞保健產(chǎn)品。

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