吳 揚，郭媛媛，張元媛，張 宜

（南通大學航海醫(yī)學研究所，江蘇南通226019）

近些年來，科學家發(fā)現(xiàn)生物體內可合成內源性H2S，它作為一種新型的調節(jié)因子和信號傳遞分子，在神經(jīng)、心血管等系統(tǒng)中發(fā)揮重要的生理調節(jié)作用，因而被稱之為繼NO和CO之后發(fā)現(xiàn)的第三種氣體信使分 子［1，2］。胱硫 醚-γ-裂 解 酶 （cystathionineγlyase，CSE）是心血管系統(tǒng)中生成內源性H2S的主要合成酶［3］。近年來，H2S作為一種重要的氣體信號分子，已成為心血管疾病研究的新靶標。研究［4，5］表明，miR-133a是心肌肥大重要的負性調控因子。CaN和 NFATc4已被證實是miR-133a的下游靶基因。H2S是否可能通過上調miR-133a表達，進而抑制其下游Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的激活，參與調節(jié)心肌肥大發(fā)生發(fā)展過程，目前尚不十分清楚。

本研究應用異丙腎上腺素（isoproterenol，ISO）建立心肌細胞肥大模型，觀察心肌細胞肥大時CSE／H2S體系的變化，明確內源性H2S在心肌細胞肥大中的作用，探討H2S對心肌細胞肥大的調控作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

炔丙基甘氨酸（propargylglycine，PAG）（Sigma，USA），rabbit anti-CaN、rabbit anti-NFATc4 （CST，USA），Lipofectamine 2000、Fluo-4／AM（Invitrogen，USA），miRNA-133a antagomir、miRNA-133a-antagmir-NC（吉瑪生物技術有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 心肌細胞培養(yǎng) 新生1～3 d SD大鼠（南通大學動物中心提供），取心臟置D-Hanks液中，將心室肌切碎約1 mm3，加入10 ml 0.125%胰酶攪拌消化。棄上清，細胞移至15%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中孵育。將細胞接種于100 mm規(guī)格的無菌培養(yǎng)皿中，于5%CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱中放置2 h。孵育后，加入Brdu使其終濃度為0.1 mmol／L。臺盼藍染色觀察細胞存活率，細胞計數(shù)后接種于6孔培養(yǎng)板。培養(yǎng)48 h后，換無血清DMEM培養(yǎng)基，24 h后加入干預因素［6］。

1.2.2 心肌細胞表面積測定 心肌細胞加ISO持續(xù)作用48 h后，在相差顯微鏡下拍照，每孔取10個視野，每個視野約20個細胞。采用Leica圖像分析系統(tǒng)，標尺測量細胞表面積，取平均值。

1.2.3 心肌細胞蛋白含量測定 將6孔板貼壁培養(yǎng)的心肌細胞用胰蛋白酶處理使其脫落懸浮，用細胞計數(shù)儀測定細胞數(shù)，一個樣本的細胞數(shù)約為（8～9）×105cells。用BCA法測定心肌細胞總蛋白含量。

1.2.4 RNA提取和qRT-PCR 樣品總RNA提取采用TRIzol試劑盒，按說明書步驟提取總RNA。逆轉錄和 qRT-PCR實驗按說明書步驟進行。BNP，β-MHC，CSE，CaN，miRNA-133a，GAPDH引物（上海生工合成）序列如下：BNP上游引物 5’-CAGCTCTCAAAGGACCAAGG-3’，BNP下游引物 5’-CACTGTGGCAAGTTTGTGCT-3’；β-MHC上游引物 5’-AACCTGTCCAAGTTCCGCAAGGTG-3’，β-MHC下游引物 5’-GAGCTGGGTAGCACAAGAGCTACT-3’；CSE上游引物5’-TCCGATGACCTCAACGAAC-3’，CSE下游引物 5’-CGGTAGCCCAGGATAAATAA-3’；CaN上游引物 5’-CCACAGGGATGTTGCCTAGTG-3’，CaN下游引物 5’-GTCCCGTGGTTCTCAGTGGTA-3’；miRNA-133a上游引物 5’-ATGGTTCGTGGGTTTGGTCCCCTTCAACC-3’，miRNA-133a下游引物 5’-GCAGGGTCCGAGGTATTC-3’；GAPDH上游引物 5’-TCTACATGTTCCAGTATGA CTC-3’，GAPDH下游引物 5’-ACTCCACGACATAC TCAGCACC-3’。將配制的溶液置于 qRT-PCR儀中進行擴增，退火溫度60℃，15 s。根據(jù)目的基因與內參基因的Ct值求得各樣本目的基因表達水平。

1.2.5 Western blot檢測 CaN、NFATc4蛋白的表達

提取各組心肌細胞總蛋白，BCA試劑盒進行蛋白定量，并調整上樣量為30μl。10%SDS-PAGE分離，PVDF膜印跡。室溫封閉2 h，加入一抗稀釋液（anti-CaN抗體 1∶1 000、anti-NFATc4抗體 1∶1 000、anti-GAPDH抗體 1∶5 000、anti-PCNA抗體 1∶1 000稀釋），4℃過夜，然后加入辣根過氧化物酶HRP標記的二抗孵育2 h。ECL化學發(fā)光顯色，X光片顯影、定影。將膠片進行掃描或拍照，美國 UVP公司GDS8000攝取圖像，Image J分析軟件對條帶進行定量分析。

1.2.6 心肌細胞轉染 每孔取1.25μl寡聚物稀釋至50μl Opti MEM培養(yǎng)液；取 1.5μl lipofectamine 2 000稀釋到50μl Opti MEM培養(yǎng)液，加至已稀釋的寡聚物中孵育。棄培養(yǎng)基，加入400μl Opti-MEM，加至心肌細胞中，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，換正常培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h后用于檢測。用于轉染的miRNA-133a抑制劑（miRNA-133a antagomir）和 miRNA-133a抑制劑的陰性對照（miRNA-133a antagomir-NC）。

1.2.7 Elisa法檢測心肌細胞內H2S含量 將心肌細胞消化后收集，加入PBS稀釋細胞懸液，細胞密度達到1×106cells／ml左右。反復凍融，使細胞破裂。4℃，2 000～3 000 r／min離心20 min，收集上清。BCA試劑盒測定各組蛋白濃度，然后進行心肌細胞內H2S含量測定。以空白孔調零，450 nm波長依序測量各孔吸光度（OD值）。

1.2.8 激光共聚焦顯微鏡檢測心肌細胞鈣離子濃度 心肌細胞加入 1 ml PBS（含 5μl Fluo-4／AM），37℃培養(yǎng)箱中避光染色30 min。用PBS洗去熒光染料，將培養(yǎng)板置激光共聚焦顯微鏡下，對心肌細胞進行掃描，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。將測取的鈣熒光圖像存入計算機，熒光強度值由Leica激光共聚焦顯微鏡自帶軟件Fluoview自動分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（±s）表示。應用GraphPad Prism5軟件進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結果

2.1 H2S對心肌細胞肥大的負性調控作用

在用 10μmol／L ISO誘導心肌細胞肥大前30 min，分別應用100μmol／L NaHS增加細胞內 H2S含量，或應用2 mmol／L PAG降低細胞內H2S含量，觀察對心肌細胞肥大的影響。實驗分組：（1）對照組、（2）ISO組、（3）NaHS組、（4）NaHS+ISO組、（5）PAG組、（6）PAG+ISO組。結果顯示：與對照組相比，ISO組或PAG組CSE mRNA表達均明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。與ISO組比較，NaHS+ISO組CSEmRNA表達顯著增加（P＜0.01），PAG+ISO組則進一步降低（P＜0.05）。NaHS組與對照組相比，無明顯差異（圖 1A）。

與對照組相比，ISO組心肌細胞內H2S含量降低（P＜0.01），NaHS組 H2S含量增加（P＜0.01），PAG組細胞內H2S含量降低（P＜0.01）。與ISO組相比，NaHS+ISO組 H2S含量增加（P＜0.01），而PAG+ISO組則進一步降低（P＜0.01，圖 1B）。

Fig.1 Effects of NaHSand PAGon the level of CSE／H2Sin the ISO-induced cardiomyotytes hypertrophy（±s，n＝4）

與對照組相比，ISO組心肌細胞表面積、蛋白含量、BNP和β-MHC mRNA表達均明顯增加（P＜0.01）。NaHS+ISO組與ISO組相比，心肌細胞表面積、蛋白含量、BNP和β-MHCmRNA表達均明顯減少（P＜0.05，P＜0.01）。PAG+ISO組與 ISO組相比，心肌細胞表面積、蛋白含量、β-MHC和BNPmRNA表達水平均增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS或 PAG組與對照組相比，均未見明顯差異（圖2）。

Fig.2 Effects of negative regulation of H2Son cardiomyocyte hypertrophy（±s，n＝4）

2.2 H2S對心肌細胞肥大抑制作用與miRNA-133a及Ca2+／CaN／NFATc4通路的關系

2.2.1 上調或下調 H2S含量對心肌細胞 miRNA-133a及Ca2+／CaN／NFATc4通路的影響 分別應用NaHS或PAG上調或下調心肌細胞內H2S含量，觀察對心肌細胞 miR-133a及 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路相關因子的影響。實驗分組同前。結果顯示：與對照組相比，ISO組miR-133a mRNA表達降低、心肌細胞內Ca2+濃度增加、CaN mRNA和蛋白表達均明顯增加、NFATc4核轉位增強、NFATc4胞漿蛋白表達減少而核蛋白表達增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS預處理組明顯逆轉ISO引起的上述效應。相反，PAG預處理組則進一步增強ISO引起的上述效應（圖 3）。

Fig.3 Effects of NaHSor PAG on the miRNA-133a and Ca2+／CaN／NFATc4 pathway in the ISO-induced cardiomyocyte hypertrophy（±s，n＝4）

2.2.2 Antagomir-133a干擾對 H2S抑制心肌細胞肥大及miRNA-133a介導的 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響 應用miRNA-133a抑制劑antagomir-133a干擾，觀察對心肌細胞肥大及Ca2+／CaN／NFATc4通路的影響。首先，檢測應用lipofectamine 2 000將antagomir-133a轉染至心肌細胞的轉染效率。結果顯示，將antagomir-133a轉染細胞后，可顯著降低miRNA-133a的表達水平，其干擾率達95%以上，表明轉染效果很好。實驗分組：（1）對照組，（2）ISO組，（3）NaHS組，（4）NaHS+ISO組，（5）antagomir-133a+NaHS+ISO組，（6）NC+NaHS+ISO組。

結果顯示，與 NC+NaHS+ISO組相比，antagomir-133a+NaHS+ISO組心肌細胞表面積、蛋白含量、BNP和β-MHC mRNA表達增加（P＜0.05）。NaHS+ISO組與NC+NaHS+ISO組相比，差異無顯著性（圖 4A、4B、4C、4D）。

與對照組相比，ISO組miRNA-133a mRNA表達降低、細胞內Ca2+濃度明顯增加、CaN mRNA和蛋白表達均增加、NFATc4核轉位明顯增強、NFATc4胞漿蛋白表達減少而胞核蛋白表達增加（P＜0.01）。與ISO組相比，NaHS+ISO組miR-133a mRNA表達升高、細胞內Ca2+濃度明顯減少、CaN mRNA和蛋白表達均降低、NFATc4核轉位減弱、NFATc4胞漿蛋白表達增加而胞核蛋白表達下降（P＜0.05，P＜0.01）；與NC+NaHS+ISO組相比，antagomir-133a+NaHS+ISO組miRNA-133a表達降低、細胞內Ca2+濃度有所增加、CaN mRNA和蛋白表達增加、NFATc4核轉位增強、NFATc4胞漿蛋白表達減少而胞核蛋白表達增加（P＜0.05，P＜0.01）。NaHS+ISO組與 NC+NaHS+ISO組相比，無統(tǒng)計學差異（圖 4E、4F、4G、4H、4I）。

Fig.4 Effects of antagomir-133a interference on cardiomyocyte hypertrophy and miR-133a-mediated Ca2+／CaN／NFATc4 signal pathway（±s，n＝4）

3 討論

本課題組以往的實驗表明［7］，應用 10μmol／L ISO誘導心肌細胞肥大，可引起心肌細胞肥大的主要指標，即心肌細胞形態(tài)和細胞表面積均明顯增大，細胞蛋白含量、以及心肌肥大標志基因BNP、β-MHC mRNA表達均增高，表明應用ISO能夠成功構建心肌細胞肥大模型。

為了探討H2S在心肌肥大中的作用，本研究應用ISO誘導心肌細胞肥大，觀察心肌細胞內CSE／H2S表達變化。結果表明，ISO誘導的心肌細胞肥大，CSE／H2S水平明顯下降。此外，應用 H2S供體NaHS上調細胞內H2S含量，或應用CSE特異性抑制劑PAG降低細胞內H2S含量，觀察對心肌細胞肥大的影響。結果發(fā)現(xiàn)，NaHS預處理能明顯抑制ISO誘導的心肌細胞表面積、蛋白含量以及 BNP、β-MHC mRNA表達水平的增加，提示NaHS能夠抑制心肌細胞肥大。相反，應用PAG預處理減少內源性H2S生成，則增強ISO誘導的心肌細胞肥大的效應。

信號轉導在心肌肥大的發(fā)生發(fā)展中是一個中心環(huán)節(jié)。有文獻報道［8］，過表達 CaN或 NFATc4的轉基因小鼠出生后可出現(xiàn)與人類心肌肥大相似的病理變化，提示心肌細胞內可能存在一條致心肌肥大的信號轉導通路，即CaN／NFATc4信號通路。CaN是一種受Ca2+調控的絲氨酸／蘇氨酸蛋白磷酸酶。在細胞信號傳遞的過程中，CaN被Ca2+激活后使胞漿中靶蛋白NFATc4脫磷酸化后入核，繼而和核內轉錄因子GATA4相互作用，激活心肌肥大相關基因表達從而誘導心肌細胞肥大。已有研究［4］證實，CaN是miR-133的下游靶基因。當心肌肥大時，miR-133表達降低、CaN的表達增加且活性增強；而當上調miR-133的表達或抑制CaN的表達則能夠對抗心肌肥大。綜上分析，我們推測H2S抑制心肌肥大作用可能與 miR-133a介導的 Ca2+／CaN／NFATc4通路相關。為了驗證兩者的關系，本研究分別應用NaHS或PAG預處理增加或減少心肌細胞內H2S的水平，觀察對心肌細胞中 miR-133a表達、以及對 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響。結果發(fā)現(xiàn)，ISO刺激能使心肌細胞miR-133a表達降低、細胞內Ca2+濃度增加、CaN mRNA及蛋白表達增加、NFATc4核蛋白表達增加及核轉位增強。應用NaHS增加細胞內H2S水平，可明顯抑制ISO誘導的上述效應；而應用PAG減少心肌細胞內H2S的生成，則明顯增強ISO誘導的肥大作用。

為了進一步探討H2S抑制心肌細胞肥大作用與miR-133a介導的 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的關系，本實驗應用miR-133a抑制劑antagomir-133a干擾ISO誘導的心肌細胞，觀察對心肌細胞肥大及Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的影響。結果發(fā)現(xiàn)，antagomir-133a能進一步加強ISO誘導的心肌細胞肥大效應，并增加ISO誘導的心肌細胞內Ca2+濃度、CaN mRNA和蛋白表達及NFATc4胞核蛋白表達、增強NFATc4核轉位。此外，antagomir-133a還能部分逆轉H2S抑制心肌細胞肥大的作用。

綜上所述，H2S可通過負性調控作用抑制心肌細胞肥大。心肌細胞肥大發(fā)生可能與CSE／H2S體系功能降低，內源性H2S合成減少有關。H2S負性調控心肌細胞肥大的作用可能與H2S上調miRNA-133a的表達，抑制其下游 Ca2+／CaN／NFATc4信號通路的激活有關。本研究進一步闡明H2S對心肌細胞肥大的調控作用及其機制，將有助于全面了解心肌肥大的病理機制，并為該疾病的防治提供新的思路和理論依據(jù)。

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