劉慶猛 李美平 吳滿武 石 丹 譚衛(wèi)峰

1.紹興第二醫(yī)院病理科，浙江紹興 312000；2.紹興市婦幼保健院病理科，浙江紹興 312000；3.紹興市婦幼保健院遺傳室，浙江紹興 312000

泛素-蛋白酶體途徑（Ubiqutin-proteasome pathway）是細(xì)胞周期調(diào)控的重要途徑之一，其作用機(jī)制通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)通路控制、蛋白酶活性調(diào)節(jié)等方式，調(diào)控某些癌基因和抑癌基因的活性，調(diào)節(jié)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而影響細(xì)胞周期進(jìn)程，參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程[1]。p27作為一種細(xì)胞周期蛋白激酶抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Cyclin-CDK復(fù)合物的受體位點(diǎn)，抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，參與細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程，被認(rèn)為是一種抑癌基因，在乳腺癌中p27呈低表達(dá),與乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)，p27失表達(dá)提示預(yù)后不良[2,3]。S期激酶相關(guān)蛋白2（S-phase kinase associated protein 2，Skp2）可通過(guò)泛素-蛋白酶體途徑，降解多種參與細(xì)胞周期調(diào)控因子，Skp2過(guò)度表達(dá)時(shí)，通過(guò)磷酸化降解p27功能區(qū)，使其失去細(xì)胞周期調(diào)控功能，細(xì)胞過(guò)度增殖，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[4,5]。Ki-67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，在乳腺癌分子分型和個(gè)體化治療方案制定中具有重要意義，Ki-67指數(shù)可作為腫瘤復(fù)發(fā)和預(yù)后評(píng)估有價(jià)值的免疫標(biāo)記[6]。Skp2、p27表達(dá)異常與多種腫瘤的發(fā)生有關(guān)，Ki-67指數(shù)在腫瘤的分級(jí)、分子分型與預(yù)后判斷中越來(lái)越受到重視，有關(guān)Ki-67指數(shù)與Skp2、p27表達(dá)異常的關(guān)系在乳腺癌中的研究國(guó)內(nèi)罕見(jiàn)報(bào)道，我們采用組織芯片技術(shù)和免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)情況，探討三者在乳腺癌中表達(dá)的意義及相互關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年3月～2016年10月期間我院收治的80例乳腺癌病例，均為女性患者，年齡32～78歲，平均（52.18±11.79）歲。所有患者術(shù)前均未進(jìn)行化療和放療。病理組織學(xué)類(lèi)型：浸潤(rùn)性癌68例，原位癌12例，其中浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌，非特殊型42例，浸潤(rùn)性小葉癌12例，特殊類(lèi)型浸潤(rùn)性癌14例（黏液癌7例，小管癌4例，實(shí)性乳頭狀癌3例），導(dǎo)管原位癌8例，小葉原位癌4例。腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)：陽(yáng)性43例，陰性37例。所有標(biāo)本均經(jīng)過(guò)10%中性福爾馬林充分固定，固定時(shí)間24～36 h，石蠟包埋。

1.2 方法

1.2.1 待測(cè)80例乳腺癌組織芯片蠟塊的制備[7]第一步：組織芯片空白蠟塊制作：組織芯片儀制作10×8點(diǎn)陣的蠟?zāi)?，大小約 3.0 cm×2.0 cm，厚度約0.6 cm，預(yù)熱后用打孔儀打孔，即制成含80個(gè)點(diǎn)陣空白蠟塊。第二步：組織芯片蠟塊制作過(guò)程：先將研究樣本蠟塊放入50℃恒溫箱中烘烤15 min左右預(yù)熱，再將蠟塊對(duì)應(yīng)的HE切片于顯微鏡下觀察，選定腫瘤組織位置后，蠟塊上進(jìn)行定位標(biāo)記，空心穿刺針鉆取目標(biāo)腫瘤組織區(qū)域，逐一轉(zhuǎn)移至空白蠟塊相應(yīng)的孔位內(nèi)填實(shí)并壓緊，待全部芯片位點(diǎn)組織填滿后，最后對(duì)含乳腺癌組織芯片的蠟塊進(jìn)行二次包埋，待自然冷卻，再放入60℃恒溫箱內(nèi)烘烤30 min后取出，即完成80例乳腺癌組織芯片蠟塊的制備。

1.2.2 采用組織芯片免疫組化檢測(cè)Skp2、p27和Ki-67蛋白的表達(dá) 本實(shí)驗(yàn)所需免疫組化檢測(cè)試劑及試劑盒購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)有限公司，免疫組化染色儀為賽墨飛Labvision Autostainer 480s，采用MaxvisionTM3二步法進(jìn)行免疫組化染色。乳腺癌組織芯片蠟塊4～5 μm厚切白片，裱于防脫粘附載玻片，經(jīng)過(guò)常規(guī)烤片、脫蠟、水化，EDTA抗原修復(fù)，染色過(guò)程由免疫組化染色儀完成，DAB顯色，根據(jù)鏡下觀察染色效果控制顯色時(shí)間，蘇木素復(fù)染，脫水、透明、封片。以已知陽(yáng)性組織作實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性外對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作陰性對(duì)照，同時(shí)以手工染色作為免疫組化儀對(duì)照組，每個(gè)免疫組化酶標(biāo)應(yīng)用兩張芯片標(biāo)記，兩份芯片檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果比對(duì)。

1.3 結(jié)果判斷

染色陽(yáng)性信號(hào)呈棕黃色顆粒，陽(yáng)性定位于細(xì)胞核為主。根據(jù)組織芯片排列的點(diǎn)陣，按順序記錄每一個(gè)芯片位點(diǎn)的免疫組化染色結(jié)果，逐一計(jì)算每個(gè)組織芯片位點(diǎn)中乳腺癌腫瘤細(xì)胞陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占比。以陽(yáng)性對(duì)照組織免疫組化染色陽(yáng)性結(jié)果可靠作為有效判讀前提，Skp2和p27的判讀標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)＜1%為陰性（－）；≥1%腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)且<25%者為陽(yáng)性（+）；腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥25%者為強(qiáng)陽(yáng)性（++）[8]。Ki-67的判讀標(biāo)準(zhǔn)：腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)<14%者為低表達(dá)組（low）；腫瘤陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≥14%者為高表達(dá)組（high）[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，Skp2、p27、Ki-67表達(dá)的計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，三者相關(guān)性采用Spearman相關(guān)檢驗(yàn)，相關(guān)系數(shù)以r表示。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織芯片免疫組化檢測(cè)結(jié)果

Skp2、p27和Ki-67免疫組化染色陽(yáng)性定位于細(xì)胞核，呈棕黃色顆粒，如封三圖3～5所示，光鏡下觀察，免疫組化染色×200倍。

2.2 不同組織學(xué)類(lèi)型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)

80例不同組織學(xué)類(lèi)型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)情況見(jiàn)表1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺浸潤(rùn)性癌中Skp2表達(dá)顯著高于原位癌，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=5.83，P<0.05），浸潤(rùn)性癌中 p27表達(dá)低于原位癌（χ2=7.86，P<0.01），浸潤(rùn)性癌中Ki-67表達(dá)顯著高于原位癌（χ2=9.17，P<0.01）。 但 Skp2、p27 和 Ki-67 的表達(dá)在浸潤(rùn)性乳腺癌不同組織學(xué)類(lèi)型中差異均無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。直線回歸相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果表明，乳腺癌的侵襲浸潤(rùn)與Skp2表達(dá)增高正相關(guān)（r=0.29），與p27失表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.31），與Ki-67表達(dá)增高正相關(guān)（r=0.34）。

2.3 不同腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)

乳腺癌不同腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)中Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)見(jiàn)表2，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組Skp2表達(dá)顯著高于陰性組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=28.56，P<0.01），腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組 p27 表達(dá)低于陰性組（χ2=22.18，P<0.01），腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組 Ki-67高表達(dá)率顯著高于陰性組（χ2=33.47，P<0.01）。直線回歸相關(guān)性檢驗(yàn)顯示，乳腺癌的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與Skp2表達(dá)增高正相關(guān)（r=0.58），與p27失表達(dá)負(fù)相關(guān)（r=-0.53），與 Ki-67 表達(dá)增高正相關(guān)（r=0.68）。

2.4 Skp2、p27和Ki-67三者表達(dá)之間的相關(guān)性

乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67三者表達(dá)之間的相關(guān)性見(jiàn)表3和表4，數(shù)據(jù)顯示Skp2在p27陽(yáng)性乳腺癌中陽(yáng)性率為19.4%，而在p27陰性乳腺癌中陽(yáng)性率為68.2%，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=20.79，P<0.01)。Ki-67在p27陽(yáng)性乳腺癌中檢測(cè)到高表達(dá)7例，低表達(dá)29例，而在p27陰性乳腺癌中檢測(cè)到高表達(dá)38例，低表達(dá)6例，二者具有顯著性差異 （χ2=34.86，P<0.01）。Ki-67在Skp2陽(yáng)性乳腺癌中檢測(cè)到高表達(dá)29例，低表達(dá)8例，而在Skp2陰性乳腺癌中檢測(cè)到高表達(dá)16例，低表達(dá)27例，二者具有顯著性差異（χ2=16.80，P<0.01）。直線回歸相關(guān)性檢驗(yàn)結(jié)果顯示乳腺癌中Skp2的高表達(dá)與p27的失表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.56），p27失表達(dá)與Ki-67的高表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.63）。Skp2與Ki-67的表達(dá)之間呈正相關(guān)性（r=0.48）。

表3 乳腺癌中p27、Skp2和Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

表4 乳腺癌中Skp2與Ki-67表達(dá)的相關(guān)性

3 討論

S期激酶相關(guān)蛋白-2（Skp2）是DNA復(fù)制所必需的人類(lèi)F-box蛋白家族中的一員。Skp2參與正常細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)，另外，Skp2還參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控。Skp2通過(guò)泛素蛋白酶水解轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮作用，并可促進(jìn)cmyc誘導(dǎo)的S期轉(zhuǎn)變和活化c-myc的靶基因。研究表明，Skp2在乳腺癌中表達(dá)增高，提示Skp2的異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生關(guān)系密切[10-12]。p27作為一個(gè)細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，通過(guò)兩條途徑發(fā)揮作用：抑制CDK激活及激活后的Cyclin-CDK復(fù)合物的活性。另外，p27可增強(qiáng)細(xì)胞間的粘附，還可誘導(dǎo)、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Skp2過(guò)度表達(dá)時(shí)，p27被過(guò)度磷酸化降解，p27失活后喪失其細(xì)胞周期調(diào)控作用，細(xì)胞增殖無(wú)限制進(jìn)行，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此，Skp2、p27Kip1異常表達(dá)與乳腺癌的發(fā)生密切相關(guān)[13-15]。本組實(shí)驗(yàn)顯示Skp2在乳腺浸潤(rùn)性癌中的表達(dá)顯著高于原位癌，提示Skp2的表達(dá)與乳腺癌的浸潤(rùn)侵襲有一定關(guān)系。腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組顯著高于陰性組，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Skp2的高表達(dá)還與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

p27蛋白缺失或低表達(dá)在惡性腫瘤中是一個(gè)較為普遍的現(xiàn)象，且低表達(dá)預(yù)示不良結(jié)局。p27通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Cyclin-CDK復(fù)合物的受體位點(diǎn)，抑制Cyclin-CDK復(fù)合物的活性，參與細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程，p27水平的下降會(huì)加速細(xì)胞周期G1期的進(jìn)展，促進(jìn)細(xì)胞不斷增殖，p27除通過(guò)影響細(xì)胞增殖和凋亡在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用外，還參與了細(xì)胞分化過(guò)程，因此它的水平高低與腫瘤的惡性程度有關(guān)，研究報(bào)道p27水平越低預(yù)示著腫瘤預(yù)后越差[16,17]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，p27在浸潤(rùn)性乳腺癌中顯著低于原位癌，且與Skp2高表達(dá)有相關(guān)性，二者共同參與乳腺癌的浸潤(rùn)進(jìn)展過(guò)程。腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組中p27的表達(dá)顯著低于陰性組，提示p27的低表達(dá)與乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。

表1 不同組織學(xué)類(lèi)型乳腺癌中Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)

表2 乳腺癌不同腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移狀態(tài)Skp2、p27和Ki-67的表達(dá)

Ki-67增殖指數(shù)高低與許多腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，在乳腺癌分子分型中Ki-67指數(shù)意義重大，2011版專(zhuān)家共識(shí)將Ki-67指數(shù)14%作為臨界值進(jìn)行Luminal A和Luminal B型區(qū)分的重要依據(jù)[9]。Ki-67指數(shù)在多種腫瘤的分級(jí)分期和預(yù)后評(píng)估中具有重要意義，大量研究結(jié)果表明，Ki-67指數(shù)可作為乳腺癌預(yù)后和療效評(píng)估有價(jià)值的免疫標(biāo)記[18-27]。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Ki-67在浸潤(rùn)性乳腺癌中的表達(dá)顯著高于原位癌，腋窩淋巴結(jié)陽(yáng)性組的表達(dá)顯著高于陰性組，表明Ki-67的高表達(dá)率與乳腺癌的浸潤(rùn)進(jìn)展程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Skp2與Ki-67的表達(dá)之間呈正相關(guān)，p27與Ki-67的表達(dá)之間呈負(fù)相關(guān)。提示在乳腺癌細(xì)胞增殖調(diào)控機(jī)制中，p27具有阻止細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，從而抑制細(xì)胞增殖，而Skp2發(fā)揮著降解細(xì)胞周期調(diào)控因子p27，促進(jìn)細(xì)胞增殖的作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，Skp2、p27和Ki-67在乳腺浸潤(rùn)性癌不同組織學(xué)類(lèi)型中表達(dá)雖然存在一定差異，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），分析其原因，可能與特殊類(lèi)型浸潤(rùn)性癌的樣本數(shù)太少有關(guān)，還有待于大樣本研究證實(shí)。1998年Kononen等[22]成功構(gòu)建組織芯片技術(shù)后，組織芯片以其高通量、高效性和低成本的技術(shù)優(yōu)勢(shì)得到廣泛應(yīng)用，特別在大樣本的研究中具有顯著優(yōu)勢(shì)。筆者應(yīng)用組織芯片技術(shù)進(jìn)行免疫組化檢測(cè)積累豐富的經(jīng)驗(yàn)，并成功地運(yùn)用組織芯片進(jìn)行熒光原位雜交（FISH）檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果與傳統(tǒng)切片檢測(cè)相符合[7]。本研究采用組織芯片對(duì)80例乳腺組織進(jìn)行免疫組化檢測(cè)，每個(gè)免疫酶標(biāo)各備用一張芯片，僅用六張芯片組織即完成全部檢測(cè)需要，極大地降低研究成本，同一免疫酶標(biāo)兩張芯片的檢測(cè)結(jié)果還可以相互比對(duì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更客觀、可靠，應(yīng)用組織芯片進(jìn)行大樣本的免疫組化研究具有高效、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)。

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