杜曉翔 陳必成

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，浙江溫州 325000

半枝蓮是我國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一，屬唇形科黃芩屬的干燥全草，味辛、平。其化學(xué)成分主要包括黃酮類、二萜類、生物堿以及多糖等，具有清熱解毒、抵抗炎癥、增強(qiáng)免疫力等功效。半枝蓮主要成分黃酮類化合物具有治療心血管疾病的作用，可以清除人體內(nèi)產(chǎn)生的自由基，同時(shí)抑制細(xì)胞凋亡，延緩衰老[1-5]。我國(guó)曾有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有抗腫瘤和治療癌癥的作用，可用于治療胃癌、直腸癌、肺癌、淋巴癌等。細(xì)胞色素P450家族為人體內(nèi)一類重要物質(zhì)，主要參與內(nèi)源性物質(zhì)及外源性物質(zhì)（藥物、環(huán)境化合物等）的代謝過(guò)程，主要分布于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體內(nèi)膜上[6-8]。研究表明，植物藥物中的活性成分可以影響細(xì)胞色素P450酶的活性，從而調(diào)控體內(nèi)藥物代謝過(guò)程。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶是藥物代謝反應(yīng)中十分重要的一種藥物代謝轉(zhuǎn)移酶，其作用是催化外源物質(zhì)的代謝，促進(jìn)內(nèi)源性化合物例如膽紅素、短鏈脂肪酸等的分解。因此，本研究選取傳統(tǒng)中草藥半枝蓮作為研究對(duì)象，選取40只SD小鼠隨機(jī)分為試驗(yàn)組（低劑量組、中劑量組、高劑量組）和對(duì)照組，每組各10只。試驗(yàn)組使用不同劑量半枝蓮醇提物對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，對(duì)照組使用等量生理鹽水，連續(xù)灌胃5 d，第6天處死小鼠，采集肝臟組織，觀察半枝蓮醇提物對(duì)于小鼠細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響。通過(guò)本次研究，我們期望可以觀察到半枝蓮提取物對(duì)于藥物代謝酶的影響，深入了解其藥物作用機(jī)制，為今后臨床用藥提供一定的參考作用。

1 資料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物與分組 40只成年雄性SD小鼠，體重均為200 g，所有大鼠均購(gòu)自上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。將40只小鼠隨機(jī)分為4組，分別為對(duì)照組（10只）和試驗(yàn)組（30只）。試驗(yàn)組根據(jù)半枝蓮醇提物灌胃劑量設(shè)立低劑量組（10只）、中劑量組（10只）和高劑量組（10只）。

1.1.2 試驗(yàn)器材和藥品 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、循環(huán)水真空泵、電加熱套、超速離心機(jī)、漩渦震蕩儀、勻漿機(jī)、電子分析天平、恒溫水浴搖床、酶標(biāo)儀、紫外可見光分度計(jì)等。

半枝蓮購(gòu)自亳州百川藥業(yè)，咪達(dá)唑侖、氯唑沙宗購(gòu)自Sigma公司，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

制備半枝蓮醇提物，將半枝蓮粉碎準(zhǔn)確稱量后加入10倍體積乙醇，靜置1 h，提取半枝蓮活性物質(zhì)后濃縮，真空干燥回收干燥產(chǎn)物，準(zhǔn)確稱量其產(chǎn)物含量，得到半枝蓮醇提物。試驗(yàn)組分別按照每天1 g/kg、5 g/kg、10 g/kg劑量進(jìn)行灌胃，分別為低劑量組（1 g/kg）、中劑量組（5 g/kg）、高劑量組（10 g/kg）。 對(duì)照組小鼠給予等量生理鹽水灌胃。小鼠室溫飼養(yǎng)，自由飲水，需在試驗(yàn)環(huán)境下適應(yīng)5 d及以上，每日早晨7點(diǎn)進(jìn)行灌胃，保證正常飲食，第5天給藥后禁食過(guò)夜。連續(xù)給藥5 d，第6天采用頸椎脫臼法處死小鼠，提取肝臟組織，使用咪達(dá)唑侖、氯唑沙宗作為藥物探針進(jìn)行體外代謝，研究半枝蓮醇提物對(duì)小鼠細(xì)胞色素P450酶活性的影響，利用蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞色素P450酶含量，利用谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶試劑盒測(cè)定谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性。

1.3 觀察指標(biāo)

觀察并記錄細(xì)胞色素P450酶含量，計(jì)算方法和公式根據(jù)Omura and Sato關(guān)于細(xì)胞色素P450含量的測(cè)定，為細(xì)胞色素 P450（nmol·mg/protein）=[（A450-A490）×1000]/（91×被測(cè)樣品蛋白濃度）。 根據(jù)體外代謝藥的產(chǎn)率計(jì)算酶活性。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，采用 t檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 半枝蓮醇提物對(duì)小鼠細(xì)胞色素P450含量及活性的影響

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組低劑量組細(xì)胞色素P450含量和活性不存在差異（P>0.05），而中劑量組和高劑量組小鼠細(xì)胞色素P450含量和活性出現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P<0.05）。 見表 1。

表1 不同組別小鼠細(xì)胞色素P450含量和活性情況比較（±s）

表1 不同組別小鼠細(xì)胞色素P450含量和活性情況比較（±s）

組別 n 細(xì)胞色素P450含量（nmol/mg protein）細(xì)胞色素P450活性（nmol/min/mg protein）對(duì)照組試驗(yàn)組低劑量組中劑量組高劑量組100.79±0.154.32±1.66 10 10 10 0.72±0.11 0.61±0.13 0.59±0.11 4.06±1.41 3.78±1.75 2.45±1.26

2.2 半枝蓮醇提物對(duì)小鼠谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響

與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性無(wú)顯著性差異（P>0.05），但中劑量組和高劑量組活性出現(xiàn)下降趨勢(shì)。見表2。

表2 不同組別小鼠谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的情況比較（x±s）

3 討論

中國(guó)地域廣闊，物種豐富，是中草藥的發(fā)源地，據(jù)統(tǒng)計(jì)目前中國(guó)大約存在有12 000種的藥用植物，在中草藥研究方面，我國(guó)也擁有著豐富的經(jīng)驗(yàn)，結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)，中草藥在臨床上的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，也得到了廣大患者和醫(yī)師的認(rèn)可。半枝蓮作為我國(guó)傳統(tǒng)中草藥之一，是馬唇形科黃芩屬多年生草本植物。全草均可入藥，性寒味酸，富含多種維生素、微量元素及氨基酸等成分，具有清熱解毒、活血祛瘀、消腫止痛、涼血解毒，清熱利濕、抗癌等功效[9-13]。細(xì)胞色素P450和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶均與體內(nèi)藥物代謝過(guò)程有關(guān)，因此,本研究通過(guò)給予小鼠不同劑量半枝蓮醇提物，觀察其對(duì)小鼠細(xì)胞色素P450酶活性和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響，從而為今后半枝蓮在臨床上的應(yīng)用提供一定的參考作用。

在本研究中，通過(guò)比較對(duì)照組小鼠和不同劑量半枝蓮醇提物組細(xì)胞色素P450酶含量和酶活性的影響，結(jié)果顯示：與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組低劑量組細(xì)胞色素P450含量和活性不存在差異（P>0.05），而中劑量組和高劑量組小鼠細(xì)胞色素P450含量和活性出現(xiàn)顯著下降的趨勢(shì)（P<0.05）。表明半枝蓮醇提物可以抑制小鼠細(xì)胞色素P450酶活性，也說(shuō)明半枝蓮提取物可以在一定程度上影響特定藥物代謝酶活性，并且半枝蓮濃度越高，抑制作用越大。此結(jié)果也與朱慧賢等[14]的研究結(jié)果一致。細(xì)胞色素P450酶可以調(diào)節(jié)肝臟對(duì)內(nèi)源性物質(zhì)和外源性物質(zhì)的代謝過(guò)程，其出現(xiàn)抑制后可以誘導(dǎo)全身藥物代謝過(guò)程異?，F(xiàn)象，最終導(dǎo)致嚴(yán)重的毒性反應(yīng)，危害患者的生命安全[15-18]。高濃度的半枝蓮可以極大程度地抑制細(xì)胞色素P450酶的活性，促進(jìn)前致癌物及毒性物質(zhì)的活化過(guò)程，有研究表明，藥物代謝性相互作用引起的藥物不良反應(yīng)有超過(guò)95%均由細(xì)胞色素P450酶引起。因此在臨床使用時(shí)需要充分考慮其不良影響。本研究還分析了半枝蓮醇提物對(duì)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：與對(duì)照組相比，試驗(yàn)組小鼠谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性沒有出現(xiàn)顯著差異（P>0.05），但中劑量組和高劑量組活性出現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。該結(jié)果說(shuō)明半枝蓮可以通過(guò)影響藥物代謝酶谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性來(lái)影響藥物代謝過(guò)程。谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶可以降低外源性化合物的毒性，具體作用機(jī)制是催化葡萄糖醛酸苷形成，加速葡萄糖醛酸苷和谷胱甘肽及其代謝產(chǎn)物結(jié)合，形成水溶性代謝產(chǎn)物[19]。有文獻(xiàn)報(bào)道，谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶還可以保護(hù)蛋白質(zhì)、核酸等遺傳物質(zhì)成分，降低癌癥的發(fā)病率[20]。眾所周知，致癌物是間接致癌物，其自身無(wú)致癌特性，但是在體內(nèi)經(jīng)過(guò)酶的活化作用，最終轉(zhuǎn)變成為親電子性終致癌物。谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶可以催化親電子化合物和內(nèi)源性谷胱甘肽結(jié)合，從而保護(hù)遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定，降低癌癥的發(fā)病率。另一方面，對(duì)于已經(jīng)代謝形成的致癌物質(zhì)，在谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶的作用下，也可以轉(zhuǎn)變形成可被機(jī)體代謝排出的水溶性物質(zhì)，抑制致癌物質(zhì)對(duì)機(jī)體的損傷作用。而本研究中發(fā)現(xiàn)了半枝蓮醇提物會(huì)抑制該酶的活性，改變藥物代謝過(guò)程，說(shuō)明半枝蓮醇提物會(huì)阻止需要谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶參與活化的物質(zhì)的形成過(guò)程。

綜上所述，半枝蓮醇提物可以對(duì)小鼠細(xì)胞色素P450酶和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶活性起到一定的抑制作用，且濃度越高，抑制程度越大，提示臨床使用半枝蓮醇提物時(shí)需要考慮藥物之間的相互作用，避免產(chǎn)生藥物毒性。

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