段天鳳,李 玲,馬紅悅,龐保平,*，單艷敏,張卓然

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學草原昆蟲研究中心,呼和浩特 010020;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站,呼和浩特 010020)

昆蟲表皮具有保護內(nèi)臟、防止水分蒸發(fā)、抵御外部有毒物質(zhì)和微生物等作用，主要由幾丁質(zhì)和表皮蛋白(cuticular protein,CP)組成。不同類型昆蟲表皮的幾丁質(zhì)種類無明顯差異，但表皮蛋白會隨著昆蟲種類、發(fā)育階段、組織特異性的不同而有差異，所以表皮蛋白的種類和數(shù)量變化是影響表皮結構及其機械性能的主要因素(Andersenatal.,1995;Cornman and Willis,2010)。表皮蛋白的組成決定了表皮的機械特性，如彈性和堅硬性(Dittmeretal.,2012)。根據(jù)幾丁結合域(chitin-binding domain,ChtBD)或保守基序，昆蟲表皮蛋白主要分為12個家族:CPR,CPF,CPFL,TWDL (Tweedle),CPAP1,CPAP3,CPG,CPLCA,CPLCG,CPLCP,CPLCW和Apidermin(Willis,2010)。昆蟲基因組分析表明，表皮蛋白基因約占編碼蛋白基因的1%，意味著表皮蛋白在昆蟲生長、繁殖、環(huán)境適應等過程中可能起著重要作用(Futahashietal.,2008;Ioannidouetal.,2014)。目前在基因組、轉錄組和蛋白組水平上已有20多種昆蟲的表皮蛋白被鑒定和分析(Liuetal.,2019;Volovychetal.,2019)。然而，表皮蛋白的種類和特征在昆蟲種類之間差異很大，從體虱Pediculushumanuscorporis的63種到埃及伊蚊Aedesaegypti的305種，而且主要集中于雙翅目和鱗翅目昆蟲(Ioannidouetal.,2014)。

沙蔥螢葉甲Galerucadaurica是近年來在內(nèi)蒙古草原猖獗發(fā)生的一種新害蟲，主要取食沙蔥Alliummongolium、野韭A.ramosum、多根蔥A.polyrhizum等百合科蔥屬Allium植物。該蟲自2009年在內(nèi)蒙古草原上突然暴發(fā)成災以來，目前發(fā)生范圍已從2009年錫林郭勒盟的4個旗擴散到錫林郭勒盟、烏蘭察布市、呼倫貝爾市、巴彥淖爾市、鄂爾多斯市和阿拉善盟6個盟市的20多個旗縣(內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站內(nèi)部資料)，危害日趨嚴重，不僅嚴重影響草原畜牧業(yè)生產(chǎn)和牧民的生活，而且使當?shù)乇疽汛嗳醯牟菰鷳B(tài)環(huán)境更加惡化。該蟲一年發(fā)生1代，以卵滯育越冬，以成蟲滯育越夏(昊翔等,2015)。單艷敏等(2019)應用RACE技術克隆了一個沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因GdAbd，并測定了其對溫度脅迫的響應。本研究基于本實驗室組裝的沙蔥螢葉甲轉錄組數(shù)據(jù)，擬對沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因進行進一步的鑒定和生物信息學分析，并對鑒定的8個代表性表皮蛋白基因在不同發(fā)育階段及幼蟲不同組織中表達譜進行分析，以期為進一步研究表皮蛋白在沙蔥螢葉甲生長發(fā)育以及抵抗環(huán)境脅迫中的作用奠定必要的基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

2019年3月將越冬卵置于溫度25±1℃、相對濕度70%±5%、光周期為14L∶10D的人工氣候箱進行孵育，以野韭飼喂。選取沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段整個蟲體樣品以及解剖獲得3齡幼蟲不同組織樣品用于后續(xù)實驗。

1.2 主要試劑和儀器

RNA提取試劑盒TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit,Premix TaqTM(TaKaRa TaqTMVersion 2.0 Plus Dye),PrmerScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit,pMD19-T Vector Cloning Kit,D500 DNA Marker,DL2000 DNA Marker,大腸桿菌EscherichiacoliDH5α感受態(tài)細胞均購自大連寶生物工程有限公司；Go Taq? qPCR Master Mix購自Promega公司；核酸瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；引物合成及序列測定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。其他試劑為國產(chǎn)分析純試劑。普通PCR儀(T100 Thermal Cycler,Bio-Rad,美國)；熒光定量PCR儀(FTC-3000P,Funglyn Biotech,加拿大)；超微量分光光度計(NanoPhotometerTMP-Class,德國)；智能型人工氣候箱(PRX-350C，寧波海曙賽福實驗儀器廠)。

1.3 沙蔥螢葉甲表皮蛋白的鑒定與分析

利用關鍵詞“cuticular protein”和“cuticle”在本實驗室組裝的沙蔥螢葉甲幼蟲和成蟲轉錄組數(shù)據(jù)庫進行直接檢索，篩選候選表皮蛋白基因。將檢索得到的序列在NCBI網(wǎng)站進行Blast驗證，去除無注釋信息或者注釋信息非表皮蛋白的序列，去除E值大于1×10-5的序列，最后去除重復序列后，利用ORF Finder (http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找候選基因序列的開放閱讀框，推測編碼氨基酸序列。分別利用 SMART 和CutProtFam-Pred (http:∥aias.biol.uoa.gr/CutProtFam-Pred/search.php)(Karouzouetal.,2007;Ioannidouetal.,2014) 對序列保守結構域進行鑒定及家族分類。

1.4 沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因的克隆和測序

根據(jù)沙蔥螢葉甲轉錄組數(shù)據(jù)，共篩選出134條注釋為表皮蛋白的unigene序列，通過生物信息學分析，選取8條位于不同系統(tǒng)發(fā)育樹分支上具有完整ORF的表皮蛋白基因片段進行克隆。利用Primer Premier 5.0 軟件設計8對引物(表1)，沙蔥螢葉甲3齡幼蟲提取總RNA后用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計測定質(zhì)量和濃度，逆轉錄生成cDNA。PCR反應體系(25 μL):cDNA模板(100 ng/μL) 1 μL,上下游引物(0.2 μmol/L)各1 μL,GoTaq? qPCR Master Mix 12.5 μL及RNase-free Water 9.5 μL。反應程序:94℃預變性3 min;94℃變性 30 s,60℃退火30 s,72℃延伸 2 min,25個循環(huán);72℃延伸7 min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后對產(chǎn)物進行回收，與pMD-19T載體連接，連接產(chǎn)物轉入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中進行轉化，吸取轉化后產(chǎn)物200 μL涂布含有氨芐西林的抗性LB平板上，過夜培養(yǎng)12～16 h，而后進行藍白斑篩選。挑取平板上的菌落進行PCR鑒定后，將條帶清晰、片段長度相符的合格菌落接種于含有10 mg/mL氨芐西林1.0 mL的LB液體培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min 搖床過夜培養(yǎng)12～16 h。然后送往生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.5 沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因的生物信息學分析

將1.4節(jié)的基因測序結果與轉錄組數(shù)據(jù)庫中鑒定出的表皮蛋白基因片段序列通過DNAMAN軟件進行比對。利用ComputePI/MW(http:∥web.expasy.org/compute_pi)進行目的基因編碼蛋白質(zhì)的等電點和相對分子量的預測分析；采用TMHMM Server V.2.0(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)和SignalP 5.1(http:∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)軟件預測是否具有跨膜域和信號肽；采用NCBI中的BlastP(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行氨基酸序列同源性分析。利用在線工具(http:∥smart.embl-heidelberg.de/)進行蛋白質(zhì)結構域預測；分別提取CP家族保守的結構域序列，利用ClustalX進行序列比對后，并用在線WebLogo工具(http:∥weblogo.berkley.edu/logo.cgi)繪出結構域LOG0圖并分析序列特征及其保守氨基酸出現(xiàn)的頻率；利用Mega 6.0軟件中的鄰接法(neighbor-joining method,NJ method)構建系統(tǒng)進化樹，重復運行1 000次。

1.6 沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因表達譜的RT-qPCR分析

按照TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit 的操作步驟，提取沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段(1齡第3天幼蟲15頭，2齡第3天幼蟲7頭，3齡第3,5,7和9天齡幼蟲及7日齡蛹及羽化當天雌、雄成蟲各3頭為1個生物學重復，3個重復)整個蟲體樣品的總RNA，使用超微量分光光度計和1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定提取的總RNA純度和質(zhì)量。按照PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit操作說明反轉錄合成cDNA第1鏈，稀釋10倍作為RT-qPCR分析的模板。以沙蔥螢葉甲SDHA(GenBank登錄號:KU240575)為內(nèi)參基因(Tanetal.,2017)(表1)，以3齡第3天幼蟲的基因表達量作為對照，qPCR方法測定表皮蛋白基因在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段的表達水平。反應體系(10 μL):模板1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL,Go Taq? qPCR Master Mix 5 μL,Nuclease-Free Water 3.6 μL。采用兩步法PCR程序進行反應，反應程序:95℃預變性10 min;95℃變性15 s,60℃退火1 min,共40個循環(huán);95℃ 15 s,60℃ 15 s,95℃ 15 s。

3齡幼蟲體型較大，為便于解剖，選取沙蔥螢葉甲3日齡3齡幼蟲進行不同組織表達譜分析。按照1.4節(jié)方法提取生成不同組織(頭部、體壁、消化道和脂肪體)的cDNA，稀釋10倍后作為qPCR分析的模板，qPCR內(nèi)參基因和方法同上，基因相對表達量計算時以頭部的基因表達量作為對照。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用2-ΔΔCt法(Livak and Schmittgen,2001)分析沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因的相對表達量，不同發(fā)育階段及3齡幼蟲不同組織相對表達量差異顯著性分析采用單因素分析法(one-way ANOVA,Duncan氏新復極差法)。利用DPS15.0 數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準誤表示。

2 結果

2.1 沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因的鑒定與序列分析

從沙蔥螢葉甲轉錄組數(shù)據(jù)庫共檢索得到134個注釋信息為表皮蛋白的序列，選取8條具有完整開放閱讀框(ORF)的表皮蛋白基因，命名為GdauCP1-8(GenBank登錄號:MN629000-MN629007)。以沙蔥螢葉甲cDNA為模板，利用設計的引物，進行中間片段的擴增，獲得預期大小的目的片段，測序結果與轉錄組數(shù)據(jù)比對一致。8條ORF長度為417～810 bp，編碼138～269個氨基酸殘基，分子量范圍為15～28 kD，等電點為4.45～8.62。SignalP均預測出16～20個氨基酸的信號肽。TMHMM分析表明GdauCP1有典型的跨膜結構，其余表皮蛋白無跨膜區(qū)。利用8個基因編碼的氨基酸序列在NCBI上進行BlastP比對分析發(fā)現(xiàn)，GdauCP3與馬鈴薯甲蟲Leptinotarsadecemlineata表皮蛋白的氨基酸序列一致性最高，為60.00%；其余GdauCP蛋白與玉米根螢葉甲Diabroticavirgiferavirgifera表皮蛋白氨基酸序列一致性最高，在58.52%～80.00%之間。

運用SMART軟件進行分析，發(fā)現(xiàn)GdauCP1-7屬于CPR家族，都具有典型的R&R保守序列結構域G-x(8)-G-x(6)-Y(x代表任意氨基酸，數(shù)字代表氨基酸數(shù)量)；GdauCP1-4都有低度復雜區(qū)且有的具有內(nèi)部重復；GdauCP5-7有的具有低度復雜區(qū)但是無內(nèi)部重復。GdauCP8不含ChtBD結構域，但有兩個低度復雜區(qū)和4個內(nèi)部重復。將其保守基序進行WedLogo分析發(fā)現(xiàn)，GdauCP1-4屬于RR-2亞家族，保守基序為G-x-Y-L-x(3)-D-G-x(2)-R-x-V-Y-T-x-D-x(3)-G;GdauCP5-7屬于RR-1亞家族，保守基序為G-x(8)-G-x(6)-Y-x-A-x(3)-G;GdauCP8的亞家族歸屬未確定。

采用從NCBI上搜索的3種鞘翅目昆蟲的44條表皮蛋白氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹,可以看出分為3支，GdauCP1-4聚為一類，該類屬于RR-2亞家族；GdauCP5-7聚為一支，該類屬于RR-1亞家族，這兩個分支都屬于CPR家族，所以為一大支；GdauCP8單獨為一類，該結果與WedLogo分析結果一致(圖1)。

圖1 基于氨基酸序列的沙蔥螢葉甲及其他昆蟲表皮蛋白系統(tǒng)進化樹(鄰接法,1 000次重復)Fig.1 Phylogenetic tree of cuticular proteins from Galeruca daurica and other insects based on the amino acid sequences (neighbor-joining method,1 000 replicates)CPs來源物種Origin species of CPs:Ldec:馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata;Dvir:玉米根螢葉甲Diabrotica virgifera virgifera;Agla:光肩星天牛Anoplophora glabripennish.

2.2 沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段表皮蛋白基因的表達譜

從圖2可知，8個GdauCP基因在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段的表達水平均存在顯著差異(P<0.05)，其中GdauCP2,GdauCP4,GdauCP5和GdauCP6在1齡幼蟲期的表達水平明顯高于其他發(fā)育階段，特別是GdauCP4約為對照3齡第3天幼蟲中表達量的15 000倍，GdauCP4和GdauCP5的表達量在其他發(fā)育階段間無顯著差異(P>0.05)；GdauCP3,GdauCP7和GdauCP8在蛹期的表達水平顯著高于其他發(fā)育階段(P<0.05)，分別約為對照3齡第3天幼蟲的50,2 000和200倍，且GdauCP7和GdauCP8的表達量在其他發(fā)育階段間無顯著差異(P>0.05)；GdauCP1在3齡第3天幼蟲期表達水平最高，其次為3齡第5天幼蟲期，再次為2齡幼蟲；除GdauCP2在成蟲中表達水平較高外(約為對照3齡第3天幼蟲的300倍)，其他GdauCP基因在成蟲中的表達水平均很低。

圖2 沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因GdauCP1-8在不同發(fā)育階段的表達分析Fig.2 Expression profiles of GdauCP1-8 at different developmental stages of Galeruca dauricaA:GdauCP1;B:GdauCP2;C:GdauCP3;D:GdauCP4;E:GdauCP5;F:GdauCP6;G:GdauCP7;H:GdauCP8.1L:1齡幼蟲1st instar larva;2L:2齡幼蟲2nd instar larva;3L3d:3齡第3天幼蟲Day-3 3rd instar larva;3L5d:3齡第5天幼蟲Day-5 3rd instar larva;3L7d:3齡第7天幼蟲Day-7 3rd instar larva;3L9d:3齡第9天幼蟲Day-9 3rd instar larva;PU:蛹Pupa;AD:成蟲Adult.圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤；柱上不同字母代表不同發(fā)育階段間基因表達量差異顯著(P<0.05,Duncan氏新復極差法)。Data in the figure are mean±SE,and different letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among different developmental stages (P<0.05,Duncan’s new multiple range method).

2.3 沙蔥螢葉甲幼蟲不同組織中表皮蛋白基因的表達譜

沙蔥螢葉甲GdauCP基因在3齡幼蟲不同組織間表達水平也存在顯著差異(P<0.05)，其中：GdauCP1在頭部和體壁中的表達水平顯著高于在消化道和脂肪體中的(P<0.05)；GdauCP2和GdauCP8在脂肪體中的表達水平明顯高于在其他組織中的(P<0.05)，其他組織間差異不顯著(P>0.05)；GdauCP3,GdauCP4,GdauCP6和GdauCP7在消化道中的表達量最高，GdauCP3,GdauCP4和GdauCP6的表達量在其他組織間差異不顯著(P>0.05)，GdauCP7在頭部的表達水平顯著高于在體壁和脂肪體中的(P<0.05)；GdauCP5在體壁中表達量最高，其他組織間表達量差異不顯著(P>0.05)(圖3)。

圖3 沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因GdauCP1-8在3齡幼蟲不同組織中的表達分析Fig.3 Expression profiles of GdauCP1-8 in different tissues of the 3rd instar larvae of Galeruca dauricaA:GdauCP1;B:GdauCP2;C:GdauCP3;D:GdauCP4;E:GdauCP5;F:GdauCP6;G:GdauCP7;H:GdauCP8.HE:頭部Head;IN:體壁Integument;DT:消化道Digestive tract;FB:脂肪體Fat body.圖中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±標準誤；柱上不同字母代表基因表達量在不同組織間差異顯著(P<0.05,Duncan氏新復極差法)。Data in the figure are mean±SE,and different letters above bars indicate significant differences in the gene expression level among different tissues (P<0.05,Duncan’s new multiple range method).

3 討論

表皮蛋白是昆蟲體壁的重要成分，昆蟲表皮的形成和發(fā)育過程離不開表皮蛋白的參與，其中分布最廣、數(shù)量最多的家族是CPR家族，包括RR-1,RR-2和RR-3等3個亞家族，其含有一個Rebers &Riddiford基序(R&R Consensus)(Rebers and Riddiford,1988)。我們從沙蔥螢葉甲幼蟲和成蟲的轉錄組數(shù)據(jù)中，共篩選出134條注釋為表皮蛋白的unigene序列，通過構建系統(tǒng)發(fā)育樹，本研究選取不同分支上8條具有完整ORF的代表性表皮蛋白基因進行原核表達、序列分析及表達譜分析。結構域和系統(tǒng)進化分析表明，GdauCP1-4屬于RR-2亞家族，GdauCP5-7屬于RR-1亞家族，GdauCP8與馬鈴薯甲蟲LdecCP18.7和玉米根螢葉甲DvirCP18.7一樣未確定類型。系統(tǒng)進化分析(圖1)表明，除GdauCP1最先與馬鈴薯甲蟲LdecCP89聚為一支，其他7個GdauCP蛋白均首先與玉米根螢葉甲表皮蛋白聚為一支。說明沙蔥螢葉甲與玉米根螢葉甲親緣關系最近，這與它們的分類地位相一致。

表皮蛋白基因在昆蟲不同發(fā)育階段或不同組織部位具有不同的表達模式，意味著其可能具有不同的功能(劉曉健等,2019)。在家蠶Bombyxmori翅原基中，RR-1表皮蛋白基因在化蛹之前和之后表達，RR-2 表皮蛋白基因在化蛹當天表達，表明RR-1和 RR-2表皮蛋白基因在家蠶翅原基內(nèi)外表皮構建中具有不同的功能(Shahinetal.,2016,2018)。在本研究中，8個表皮蛋白基因在沙蔥螢葉甲不同發(fā)育階段表達模式不同。GdauCP4-6在1齡幼蟲中高度表達，特別是GdauCP4約為對照3齡第3天幼蟲中表達量的15 000倍(圖2:D)，可能在1齡幼蟲表皮形成過程中起著重要作用。然而，中紅側溝繭蜂Microplitismediator大多數(shù)表皮蛋白基因表達量隨幼蟲齡期的增加而升高(Volovychetal.,2019)。GdauCP7和GdauCP8在蛹期的表達量最高，分別約為對照的2 000和200倍(圖2:G,H)，可能與蛹期表皮形成或羽化有關。除GdauCP2在成蟲中表達量較高外，其他GdauCP基因在成蟲中均低表達(圖2:B)。轉錄組學分析也表明，馬尾松毛蟲Dendrolimuspunctatus絕大多數(shù)表皮蛋白基因在成蟲期低表達，只有少數(shù)在成蟲期高表達(Yangetal.,2017)，但松墨天牛Monochamusalternatus表皮蛋白基因MoalICP在成蟲中表達量最高(許雯等,2014)。賈盼等(2019)研究發(fā)現(xiàn)，飛蝗Locustamigratoria表皮蛋白基因LmAbd-2在各個齡期內(nèi)表皮形成時期呈周期性高表達，可能與表皮的合成和沉積有關。在本研究中，雖然對3齡幼蟲期也進行了不同日齡的劃分，但未發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象?？赡芘c昆蟲或表皮蛋白種類有關，也可能與發(fā)育階段劃分不夠細致有關。今后應將1齡幼蟲、2齡幼蟲和蛹期進行更細致的劃分，以確定沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因表達是否也有類似現(xiàn)象。

沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因組織特異性表達分析表明，不同GdauCP表達模式不同。GdauCP1在沙蔥螢葉甲3齡幼蟲頭部和體壁中表達量最高(圖3:A)，家蠶表皮蛋白BmCPAP3-G也具有類似的表達模式(張薇薇等,2017)。GdauCP5在3齡幼蟲體壁中高度表達，而在其他組織中低表達(圖3:E)。飛蝗LmAbd-2也在體壁中高表達而在其他組織中低表達，在飛蝗蛻皮過程中參與內(nèi)表皮的形成(賈盼等,2019)。GdauCP2和GdauCP8在沙蔥螢葉甲3齡幼蟲脂肪體中的表達量明顯高于其他組織中的(圖3:B,H)，Majerowicz等(2017)在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster的研究中也獲得了相同的結果。GdauCP3,GdauCP4,GdauCP6和GdauCP7在沙蔥螢葉甲3齡幼蟲消化道中的表達量最高(圖3:C,D,F,G)，飛蝗的2個表皮蛋白基因Obst-D和Obst-E也主要在消化道中表達(王燕等,2015)。

近年來RNAi技術的快速發(fā)展，極大地促進了昆蟲基因功能的研究。目前已有人應用該項技術研究了赤擬谷盜Triboliumcastaneum(Arakaneetal.,2012)和褐飛虱Nilaparvatalugens(馬艷等,2013;Luetal.,2018;Panetal.,2018)表皮蛋白基因的功能，表明表皮蛋白基因在昆蟲表皮的形成過程中起著重要作用。這些研究為后續(xù)深入挖掘沙蔥螢葉甲表皮蛋白基因的功能具有重要的參考價值。昆蟲表皮蛋白生物學功能的解析，不僅可以為深入認識昆蟲表皮發(fā)育機制提供參考，而且可以為開發(fā)害蟲防治新技術提供理論依據(jù)。