孟憲珺

摘 要：本試驗精液來自羅曼種公雞，以6種抗凍劑組合：10%乙二醇（Ethylene Clycol，EG）+5%二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide，DMSO）（胞內(nèi)抗凍劑組合）、5% EG+10% DMSO（胞內(nèi)抗凍劑組合）、5%甘油+4%蔗糖（胞內(nèi)外抗凍劑混合組合）、10%甘油+4%蔗糖（胞內(nèi)外抗凍劑混合組合）、5%蔗糖+10%聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）（胞外抗凍劑組合）和10%蔗糖+5% PEG（胞外抗凍劑組合）以及基礎(chǔ)液配成A1、A2、A3、A4、A5和A6六種冷凍稀釋液，進(jìn)行冷凍保存。結(jié)果表明，6種稀釋液平均精子凍后活率依次為0. 600±0.183、0.600±0.082、0.400±0.083、0.370±0.171、0.100±0.000和0.225±0.150。A1、A2、A3、A4的凍后活率極顯著高于A5、A6（P<0.01）;其余各組合之間均差異不顯著（P>0.05）。

關(guān)鍵詞：雞精液;精子活率;抗凍劑;凍后活率

中圖分類號：S 831.4

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1001-0769（2018）10-0064-02

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和研究手段的不斷完善，動物人工授精技術(shù)已成為家畜家禽改良的重要手段，而精液冷凍保存在人工授精中起著重要作用。目前，已有許多資料表明抗凍劑對牛、馬等一些大家畜精液有保護(hù)作用。在家禽方面，Polge在1951年第1次用冷凍精液獲得孵化小雞，Ohara等和Schramm等認(rèn)為用冷凍精液輸精的受精率高于雞自然交配的受精率。還有不少學(xué)者的試驗結(jié)果表明冷凍精液的受精率低于新鮮精液。我國雖有家禽冷凍精液方面的研究，但仍處于試驗階段，并未能在生產(chǎn)中推廣運(yùn)用，主要原因是雞精子抗凍能力較差，冷凍后精子活率太低。故本試驗旨在探討不同抗凍劑對雞精液冷凍保存效果的影響。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗動物

試驗動物為體質(zhì)健康、精液品質(zhì)優(yōu)良的羅曼種公雞。種公雞飼養(yǎng)于同一雞舍內(nèi)，采用二階梯單籠飼養(yǎng)。整個試驗期內(nèi)自由采食和飲水，日喂1次（9：00～10： 00），自由飲水，雞舍溫度保持在20℃～25℃，濕度為50%～68%。

基礎(chǔ)日糧組成：玉米751.40 g/kg，豆粕98.10 g/kg，麩皮84.00 g/kg，沸石粉3.00 g/kg，硫酸錳0. 30 g/kg，磷酸氫鈣18.50 g/kg，石粉35.00 g/kg，食鹽3.0 g/kg，米糠2.59 g/kg，硫酸亞鐵0.26 g/kg，亞硒酸鈉0.08 g/kg，賴氨酸1. 10 g/kg，蛋氨酸1.30 g/kg，硫酸銅0.22 g/kg，氯化膽堿0. 88 g/kg，牧樂維他0.29 g/kg;營養(yǎng)水平及含量：鈣10.0 g/kg，粗蛋白116.8 g/kg，代謝能12.3 MJ/kg，總磷6.5 g/kg，有效磷4.2 g/kg，可消化蛋氨酸3.1 g/kg，可消化賴氨酸5.8 g/kg。

1.1.2試劑

分析純化學(xué)試劑主要有果糖、磷酸二氫鉀、蔗糖、磷酸氫二鈉、二甲基亞砜（Dimethyl Sulfoxide， DMSO）、聚乙二醇（Polyethylene Glycol，PEG）、乙二醇（Ethylene Glycol，EG）、卵黃、醋酸、龍膽紫和蒸餾水等。

1.1.3主要儀器

電子分析天平、生物顯微鏡、電熱恒溫水浴鍋、普通溫度計、酸度計、容量瓶、滲透壓儀、普通冰箱、液氮罐和移液器等（表1）。

1.2方法

1.2.1精液采集

采用背腹按摩法采集精液，將采得的雞精液用紗布過濾，注意在采集中減少糞便、血液、尿酸鹽等的污染。然后將集精瓶用毛巾包好迅速帶回實驗室，運(yùn)送過程中，盡量避免震蕩，防止陽光直射。采集到的原精混合后活率要求在80%以上方可用于冷凍試驗。

1.2.2稀釋液的配制

稀釋液配方是根據(jù)雞精液特性，從營養(yǎng)物質(zhì)選擇、滲透壓、pH、緩沖能力等方面進(jìn)行考慮并確定用量。按配方準(zhǔn)確稱取所用試劑，用蒸餾水溶解，濾紙過濾，定容至100 mL，100℃水浴加熱消毒30 min，室溫冷卻后封蠟，陰涼處保存?zhèn)溆谩；A(chǔ)液（I液）用果糖9. 002 g、蔗糖17. 114 g、磷酸二氫鉀0.461 g、磷酸氫二鈉0. 783 g配制成滲透壓512 mOsm、pH為6. 74的溶液。冷凍液（II液）以基礎(chǔ)液（Ⅰ液）中加入6種不同抗凍劑組合，胞內(nèi)抗凍劑（10% EG+5%DMSO、5% EG+10% DMSO）、胞內(nèi)外抗凍劑（5%甘油+4%蔗糖、10%甘油+4%蔗糖）、胞外抗凍劑（5%蔗糖+ 10%PEG、10%蔗糖+5%PEG）配成Al、A2、A3、A4、A5、A6溶液。

1.2.3精液的稀釋與平衡

精液采集后以0.2 mL劑量分裝于青霉素小瓶，以同溫度冷凍液與精液1：1的比例稀釋，加入卵黃，用棉花包裹放入冰箱內(nèi)緩慢降溫到4℃～5℃，平衡1 h。

1.2.4冷凍

用吸管吸取平衡后的精液滴于用液氮（- 196℃）冷卻到- 80℃～- 120℃左右的銅網(wǎng)的表面，制成小冷凍顆粒（每個顆粒大小為0.1 mL）。滴凍要求快速、均勻，滴凍結(jié)束應(yīng)使精液顆粒停留2 min～5 min，待顆粒由黃變白，即可將銅網(wǎng)浸入液氮。

1.2.5解凍

解凍采用溫水解凍法（干解凍），溫水解凍法是將1～2個顆粒冷凍精液置于薄壁小試管中，在40℃水浴中不停地?fù)u動觀察，待顆粒大部分（75%左右）融解時，將小試管從水浴中取出，然后將小試管底部握在手中（以體溫防止解凍不完全或解凍過度燙死精子）并不停搖動直至完全融化。鏡檢凍后精子活率，并做好記錄。

1.2.6活率檢查

精液冷凍前，制片置于400倍顯微鏡下觀察精液的原精活力并記錄;解凍后，繼續(xù)將解凍后的精液制片置于顯微鏡下觀察凍后活率。視全部精子為直線運(yùn)行定為1.0，50%的精子呈直線運(yùn)行定為0.5，10%的精子呈直線運(yùn)行定為0.1，按此依次類推。

1.2.7數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用sPss軟件進(jìn)行方差分析。差異顯著時，用Tukey法進(jìn)行多重比較。

2結(jié)果與分析

2.1凍后活率

各組合凍后活率見表2。

由表2可以看出，A1、A2、A3和A4的凍后活率極顯著高于A5和A6（P<0.01）;其余Al、A2與A3、A4;A3、A4與A5、A6之間凍后均差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

冷凍保護(hù)劑依其滲透性的不同可以分為胞內(nèi)（滲透性）抗凍劑和胞外（非滲透性）抗凍劑。本試驗選用DMSO、EG和甘油3種滲透性抗凍劑和蔗糖、PEG兩種非滲透性抗凍劑，以研究不同抗凍劑對雞精子的冷凍保護(hù)作用。試驗結(jié)果表明，A1、A2、A3和A4的凍后活率極顯著高于A5和A6（P<0.01）;這是由于EG、DMSO和甘油為胞內(nèi)抗凍劑，滲透性抗凍劑部分是通過進(jìn)入細(xì)胞取代細(xì)胞內(nèi)水分，這種取代使細(xì)胞脫水或結(jié)合細(xì)胞水，以阻止細(xì)胞內(nèi)冰晶形成，使水處于過冷狀態(tài)，降低危險區(qū)的上限，縮小危險溫區(qū)的范圍。滲透性抗凍劑不僅對細(xì)胞內(nèi)部，且對原生質(zhì)膜也有保護(hù)作用。而蔗糖和PEG為胞外抗凍劑，不能進(jìn)入細(xì)胞取代細(xì)胞內(nèi)水分，使精子不能像胞內(nèi)抗凍劑進(jìn)行保護(hù)，使精子的活率低于胞內(nèi)抗凍劑的精子活率。并且各種抗凍劑雖能在冷凍過程中起到保護(hù)精子的作用，但又有毒害作用，使精子的活率明顯比凍前活率降低，這也是影響冷凍效果的一個原因。

4結(jié)論

胞內(nèi)抗凍劑比胞外抗凍劑的凍后活率高，故在生產(chǎn)實踐中，建議采用胞內(nèi)抗凍劑和胞外抗凍劑混合組合，既可以滿足凍后活率大，也可使精子形態(tài)保持完整。