曾小玲 趙瑞麗 鐘開(kāi)勤 朱朝輝 陳敏氡

摘 要 采用同源克隆法從菜心中獲得cDNA全長(zhǎng)459 bp的E2基因，命名為BclUBE2。該基因編碼153個(gè)氨基酸，分子量為17.24 ku，理論等電點(diǎn)為5.37，為親水性非分泌蛋白。結(jié)構(gòu)分析顯示，該蛋白含有一個(gè)泛素結(jié)合酶E2活性位點(diǎn)、一個(gè)WD重復(fù)序列和一個(gè)高度保守的半胱氨酸。進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，菜心BclUBE2蛋白與蕓薹屬蕪菁和油菜的親緣關(guān)系較近。qRT-PCR分析表明，菜心BclUBE2基因在根、莖、葉、葉柄中均有表達(dá)，且表達(dá)豐度和變化趨勢(shì)不同。在低溫脅迫下，根中的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，且在處理1 h時(shí)表達(dá)量最低；在莖、葉、葉柄中均呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)趨勢(shì)，莖和葉柄處理6 h時(shí)的表達(dá)量最高，葉片處理1 h時(shí)的表達(dá)量最高。說(shuō)明菜心BclUBE2基因在響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮作用。

關(guān)鍵詞 菜心；BclUBE2基因；qRT-PCR

中圖分類號(hào) S634.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The ubiquitin-conjugating enzyme E2 gene was cloned from Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee and designated as BclUBE2. The full cDNA length of BclUBE2 was 459 bp， encoding 153 amino acid residues with an estimated molecular mass of 17.24 ku and a calculated pI of 5.37. This protein was hydrophilic non-secretory. Structural analysis revealed that the sequence contained an E2 ubiqitin-conjugating enzyme active site， a WD-repeated sequence and a highly conserved cysteine. Phylogenetic analysis showed that BclUBE2 protein had the closest relationship with Brassica napus and Brassica rapa. qRT-PCR results showed that the existence of BclUBE2 was detectable in the root， stem， leaf and petiole with different expressive abundance and change trend. Under low temperature stress， the expression level in the root showed the trend of decreasing first and then increasing， and reached the lowest level at 1 h. However， the expression level in the stem， leaf and petiole increased first and then decreased with the highest level at 6 h in stem and petiole and at 1 h in leaf. These results indicated that BclUBE2 gene was involved in plant response to low temperature stress.

Keywords Brassica campestris L. ssp.chinensis var. utilis Tsen et Lee； BclUBE2 gene； qRT-PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.014

菜心（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）是十字花科蕓薹屬白菜亞種的一個(gè)變種，以花薹為食用產(chǎn)品的蔬菜，又名菜薹，是我國(guó)南方的特產(chǎn)蔬菜之一。菜心品質(zhì)柔嫩，營(yíng)養(yǎng)豐富，越來(lái)越受到人們的喜愛(ài)，其栽培面積越來(lái)越大。菜心喜溫，溫度過(guò)高或過(guò)低，會(huì)導(dǎo)致菜薹纖細(xì)，產(chǎn)量低，質(zhì)量差。因此，研究菜心在低溫脅迫下的反應(yīng)，探究菜心自身抵御低溫的能力，對(duì)培育出抗低溫菜心品種具有重要意義。

泛素結(jié)合酶E2（ubiquitin conjugating enzyme E2）是將活化的泛素分子轉(zhuǎn)移到靶蛋白，從而催化泛素降解途徑的關(guān)鍵酶之一，決定泛素鏈的長(zhǎng)度、拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)、泛素化修飾的特異性、精確性和蛋白泛素化效率等[1-2]，在植物的整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)構(gòu)建方面發(fā)揮重大作用[3]，如番茄泛素結(jié)合酶基因在葉片衰老過(guò)程中表達(dá)[4]；棉花GhUBC1/2 基因在葉片和花衰老時(shí)上調(diào)表達(dá)[5]；擬南芥AtUBC2 基因可通過(guò)激活抑制開(kāi)花基因及相關(guān)功能基因的表達(dá)抑制開(kāi)花[6]。E2蛋白在逆境脅迫過(guò)程中也發(fā)揮重要作用，如NbUbc2基因通過(guò)負(fù)調(diào)控抗病基因 SGT1的表達(dá)來(lái)提高本氏煙葉片的抗病性[7]；橡膠樹(shù)HbUBC22能夠響應(yīng)乙烯脅迫反 應(yīng)[8]；耐鹽檉柳E2蛋白基因轉(zhuǎn)煙草能夠提高其耐旱性[9]；小白菜BcUBCE2基因在銅脅迫下表現(xiàn)出上調(diào)表達(dá)[10]；水茄StUBCc基因能夠響應(yīng)黃萎病菌誘導(dǎo)過(guò)程[11]。這些研究表明，E2基因能夠直接或間接調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育和逆境反應(yīng)過(guò)程。目前，關(guān)于菜心泛素結(jié)合酶E2基因功能的研究鮮少人報(bào)道。本研究通過(guò)同源克隆方法獲得菜心BclUBE2基因的cDNA全長(zhǎng)，分析其序列特征，同時(shí)分析該基因在不同時(shí)空的表達(dá)模式，以期為菜心耐低溫機(jī)理研究奠定一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 供試菜心品種為福州市蔬菜科學(xué)研究所培育的“綠星菜心”品種，試驗(yàn)于2017年8—10月在福州市蔬菜科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。1.1.2 試劑 Trizol Up、EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix、TransStart? Top Green qPCR SuperMix 購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司，RevertAit First strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒購(gòu)自 Thermo 公司，pMD-18T Vector、E. coli DH5α competent cells購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 將菜心種子播種于盛有育苗基質(zhì)的穴盤中育苗，待長(zhǎng)至3～4片真葉時(shí)，選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移至人工氣候箱進(jìn)行低溫處理，溫度為4 ℃、濕度60%、光照100%。低溫處理0、1、3、6、12 h時(shí)采集根、莖、葉柄和第3片真葉（去除主葉脈），液氮速凍后放置-80 ℃冰箱中保存待用。

1.2.2 總 RNA 提取與cDNA的合成 菜心總RNA提取參考Trizol 試劑說(shuō)明書(shū)。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其完整性與純度，選取無(wú)污染、無(wú)降解、條帶清晰的RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，cDNA的合成參考試劑盒EasyScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的說(shuō)明書(shū)。

1.2.3 基因全長(zhǎng)的擴(kuò)增與功能分析 參考NCBI網(wǎng)站發(fā)布的十字花科油菜（XM_013809488.2）、甘藍(lán)（XM_013762644.1）、蕪菁（NM_001301933.1、XM_009102991.2、KF148023.1）E2基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物UE2-F、UE2-R擴(kuò)增菜心BclUBE2蛋白基因ORF（表1），將獲得的片段回收、純化后送北京六合華大科技有限公司測(cè)序。

1.2.4 生物信息學(xué)分析 采用以下軟件分析氨基酸序列：基本理化性質(zhì)用Protparam（http：//web. expasy.org/protparam/）預(yù)測(cè)；疏水性用Protscale （http：//web.expasy.org/protscale/）默認(rèn)算法（Hphob./ Kyte&Doolittle）預(yù)測(cè)；跨膜結(jié)構(gòu)用TMHMM-2.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)；信號(hào)肽用SignalP（http：//www. cbs. dtu.dk/ services/SignalP/）預(yù)測(cè)；二級(jí)結(jié)構(gòu)應(yīng)用SOPMA （https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_au?tomat.pl？ page=npsa_sopma.html）預(yù)測(cè)，功能位點(diǎn)用Expasy（http：//prosite.expasy.org/）分析。將獲得的片段在NCBI上用 BLAST進(jìn)行同源序列搜索，選取同源性、可靠性高的E2蛋白序列，應(yīng)用DNAMAN和MEGA 5.2軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建。

1.2.5 基因表達(dá)特性分析 將處理0、1、3、6、12 h時(shí)的根、莖、葉、葉柄的總RNA進(jìn)行提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將其稀釋至100 ng/ul作為 RT-PCR的模板。以菜心Actin基因?yàn)閮?nèi)參（actin-F、actin-R），根據(jù)菜心E2基因序列設(shè)計(jì)特異性引物（RTUE2-F、RTUE2-R）。參考北京全式金生物技術(shù)有限公司的TransStart? Top Green qPCR SuperMix試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行熒光定量分析，采用公式：目的基因的相對(duì)含量=2CT 計(jì)算E2基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用EXCEL軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的基本處理，采用DPS軟件進(jìn)行單因素方差分析及差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BclUBE2基因全長(zhǎng)的克隆與分析

以UE2-F、UE2-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將目的片段進(jìn)行回收測(cè)序，獲得一個(gè)459 bp的菜心泛素結(jié)合酶E2基因的cDNA擴(kuò)增片段（命名為BclUBE2）（圖1），該序列編碼153個(gè)氨基酸，含起始密碼子ATG和終止密碼子TAG（圖2）。

2.2 生物信息學(xué)分析

BclUBE2基因編碼的蛋白質(zhì)的分子量為17.24 ku，理論等電點(diǎn)為5.37，所帶Arg+Lys總數(shù)為16，Asp+Glu總數(shù)為18，為酸性蛋白。疏水性分析顯示，該蛋白為親水性蛋白，37位的天冬酰胺（N）疏水性最強(qiáng)，136位的谷氨酸（E）親水性最強(qiáng)，不存在跨膜區(qū)和信號(hào)肽，為非分泌蛋白。該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)以Alpha helix和Random coil為主，分別為38.16%和 38.82%，Extended strand和Beta turn相對(duì)較少，分別為18.42%和4.61%。

結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)顯示，BclUBE2蛋白的氨基酸序列第7～139位為泛素結(jié)合酶E2家族序列，其中24～38位為WD重復(fù)序列，77～92位為泛素結(jié)合酶活性位點(diǎn)，88位為高度保守的半胱氨酸殘基活性位點(diǎn)。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，E2家族序列在物種進(jìn)化上高度保守（圖3）。將菜心BclUBE2蛋白與其他物種的18條E2蛋白序列進(jìn)行聚類分析，結(jié)果表明菜心BclUBE2蛋白與蕓薹屬蕪菁、油菜、白菜的親緣關(guān)系較近（圖4）。

2.3 BclUBE2基因的特異性表達(dá)

由圖5可知，在低溫處理0 h時(shí)，菜心BclUBE2基因在根、莖、葉、葉柄中均有表達(dá)，但其在不同組織器官中的表達(dá)豐度不同。在葉柄中的表達(dá)量最低，葉中最高，為葉柄的16.23倍；莖中次高，為葉柄的12.19倍；根中的表達(dá)量為葉柄的5.83倍。在低溫處理下，BclUBE2基因在不同組織中呈現(xiàn)的變化趨勢(shì)不同，根中的表達(dá)量呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，且在處理1 h時(shí)其表達(dá)量最低；在莖、葉、葉柄中均呈現(xiàn)出相反的表達(dá)趨勢(shì)，其中，莖和葉柄處理6 h時(shí)的表達(dá)量最高，葉片處理1 h時(shí)的表達(dá)量最高。

3 討論

本研究獲得全長(zhǎng)459 bp的菜心BclUBE2基因，該基因編碼的蛋白由153個(gè)氨基酸組成，含有一個(gè)泛素結(jié)合酶E2活性位點(diǎn)、一個(gè)WD重復(fù)序列和一個(gè)高度保守的半胱氨酸，屬于第1類E2蛋白。多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，E2蛋白在物種間高度保守，而進(jìn)化分析結(jié)果顯示，菜心BclUBE2蛋白與蕓薹屬蕪菁、油菜、白菜的親緣關(guān)系較近，與蘿卜屬蘿卜的親緣關(guān)系較同屬物種甘藍(lán)近，這說(shuō)明物種間E2蛋白序列較保守。

許多研究表明泛素結(jié)合酶E2蛋白在植物器官中普遍存在，如小麥TaE2基因在根、莖、葉和種子中均有表達(dá)[12]；巴西橡膠樹(shù)HbUBC5基因

在樹(shù)皮、乳膠、葉片和花中均有表達(dá)，且在樹(shù)皮中的表達(dá)量最高，乳膠和葉片相對(duì)較低[13]；蕪菁 BrUBC11基因在花瓣、花蕾、樹(shù)皮中均有表達(dá)，且在花瓣中的表達(dá)量最高，花蕾次之[14]；龍葵SorUBC基因在根、莖、葉、花和果實(shí)中均有表達(dá)，葉片和果實(shí)最高，其次為莖、花，根最低[15]；鐵皮石斛DoUBC24基因在根、莖、葉和花中的表達(dá)量依次為花>莖>種子>根>葉[16]；玉米ZmUBC- 76基因的表達(dá)量在根和幼果中最高，穗絲中最 低[17]。本研究結(jié)果顯示，菜心BclUBE2基因在根、莖、葉和葉柄中也均有表達(dá)，其表達(dá)量

在葉柄中最低，葉最高，為葉柄的16.23倍；莖次高，為葉柄的12.19倍；根中的表達(dá)量為葉柄的5.83倍。這些研究結(jié)果說(shuō)明E2蛋白在植物的不同組織器官間不具備特異性，但在不同組織器官中的表達(dá)水平不同，具有表達(dá)特異性。

植物在抵御不良環(huán)境脅迫的過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生導(dǎo)致植物非正常生長(zhǎng)的大量異常蛋白，泛素結(jié)合酶E2蛋白能夠?qū)⒒罨姆核胤肿愚D(zhuǎn)移至靶蛋白上，從而降解異常蛋白，是泛素蛋白酶體途徑降解異常蛋白的重要酶類，在清除異常蛋白的過(guò)程中具有重大作用[18-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，在低溫脅迫下，菜心BclUBE2基因的表達(dá)量在不同器官的變化趨勢(shì)不同，在根中呈現(xiàn)先降低后升高的變化趨勢(shì)，且在處理1 h時(shí)其表達(dá)量最低；在莖、葉、葉柄中均呈現(xiàn)先升高后降低的表達(dá)趨勢(shì)，莖和葉柄處理6 h時(shí)的表達(dá)量最高，葉片處理1 h時(shí)的表達(dá)量最高，說(shuō)明菜心BclUBE2基因在響應(yīng)低溫脅迫中發(fā)揮作用。蔡佳文等[15]研究發(fā)現(xiàn)，龍葵葉片SorUBC基因在低溫脅迫下的表達(dá)量均低于對(duì)照，呈現(xiàn)出先降低再升高的變化趨勢(shì)，根部SorUBC基因呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)；花生和香蕉E2基因在低溫脅迫下呈上調(diào)表達(dá)[22-23]；玉米ZmUBC-76基因的表達(dá)量在低溫脅迫時(shí)變化不顯著[17]。這些研究結(jié)果說(shuō)明，泛素結(jié)合酶E2蛋白在抵御植物低溫脅迫時(shí)發(fā)揮作用，但其表達(dá)模式在不同植物間不完全相同，防御低溫機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

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