羅云 趙方方 馬晨 呂岱竹 王明月

摘 要 建立了高效液相色譜法測(cè)定香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的分析方法：香蕉樣品經(jīng)甲醇漩渦提取，采用多壁碳納米材料（MWCNTs）分散固相萃取凈化。5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的分離采用C18色譜柱，以0.05 mol/L乙酸鈉水溶液-甲醇為流動(dòng)相。目標(biāo)物質(zhì)的線性范圍為0.25～5mg/L，標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.99以上；平均加標(biāo)回收率（n=6）為74.0%～110%，RSD≤3.99%。該方法簡(jiǎn)單快捷，重復(fù)性好，可用于香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的測(cè)定。

關(guān)鍵詞 香蕉；5-羥色胺；色氨酸；褪黑素；高效液相色譜法

中圖分類(lèi)號(hào) S668.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The objective of the study was to establish a method for the determination of serotonin， tryptophan and melatonin in bananas by high performance liquid chromatography （HPLC）. The methods of extraction， purification and detection for the three amines were optimized. The analytes in bananas were extracted by whirlpool mixer with methanol， purified with multi-walled carbon nanomaterials （MWCNTs）， separated on a C18 column. The mobile phase was consisted of methanol and 0.05 mol/L sodium acetate. The linear range of the target material was 0.25-5 mg/L. The calibration curves of the analytes showed a good linear relationship， and the correlation coefficient was above 0.99. The average recoveries were in the range of 74.0%–110% with relative standard deviation （RSD） less than 3.99% （n=6）. The method is simple， rapid and with good reproducibility and can be used in the determination of serotonin， tryptophan and melatonin in bananas.

Key words banana； serotonin； tryptophan； melatonin； high performance liquid chromatography

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.04.027

香蕉作為世界四大水果之一，因其口感獨(dú)特、香甜美味，深受廣大消費(fèi)者的喜愛(ài)。香蕉不僅富含糖、蛋白質(zhì)、維生素、微量元素等營(yíng)養(yǎng)成分，還含有類(lèi)胡蘿卜素、多酚、多糖等活性成分，具有抗氧化、抗?jié)儭⒔笛?、治腹瀉、抗腫瘤、抗抑郁等保健功效[1]。香蕉具有眾多功能成分而被廣泛關(guān)注。關(guān)于香蕉多糖、多酚的研究已有不少，而有關(guān)香蕉中功能性成分胺類(lèi)物質(zhì)的文獻(xiàn)報(bào)道較少，其中色氨酸（tryptophan，Trp）是人體必需氨基酸，體內(nèi)無(wú)法合成，必須從食物中攝取。色氨酸是合成5-羥色胺（serotonin，5-HT）和褪黑素（melatonin，MT）的前體。5-羥色胺有抗氧化活性，能清除游離的自由基，具有調(diào)節(jié)人體內(nèi)免疫反應(yīng)、抑制脂肪形成、抑制腫瘤、強(qiáng)烈抑制黑色素生成、保護(hù)人體中的自然殺傷細(xì)胞免受程序性死亡等功能[2-6]。褪黑素具有抗氧化作用，能清除生物體內(nèi)的自由基，延緩衰老，同時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、改善睡眠、抗癌、抗心血管疾病等作用[7-10]。因此研究香蕉中的5-羥色胺、色氨酸、褪黑素對(duì)擴(kuò)展香蕉功能性營(yíng)養(yǎng)以及提高產(chǎn)業(yè)發(fā)展水平具有重要意義。

目前植物中5-羥色胺、色氨酸、褪黑素通常采用薄層色譜法（Thin Layer Chromatography，TLC）[11]、熒光分光光度法（Fluorescence analysis，F(xiàn)L）[11]、分子熒光法（Molecular Fluorescence Spectrometry）[12]、高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）[13-14]或高相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（High Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry HPLC-MS/MS）[15]測(cè)定。常用固相萃取小柱如C18、HLB等[12-13]進(jìn)行凈化處理。近年來(lái)有大量關(guān)于分散固相萃?。―isperse solid phase extraction，DSPE）的研究發(fā)表，分散固相萃取法是植物中農(nóng)藥分析常用的凈化方法，但運(yùn)用到營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)檢測(cè)領(lǐng)域的報(bào)道很少。分散固相萃取操作簡(jiǎn)單，能有效除去樣品中的雜質(zhì)，減少基質(zhì)干擾。本研究采用分散固相萃取法對(duì)香蕉中3種目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行凈化處理，并比較了HLB填料、WCX填料和多壁碳納米管（Multiwalled carbon nanotubes，MWCNTs）的凈化效果，其中MWCNTs是一種吸附性能很強(qiáng)的材料，是較為理想的凈化填料，能有效降低基質(zhì)干擾，實(shí)現(xiàn)快速準(zhǔn)確分析。本研究旨在建立高效液相色譜法測(cè)定香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 香蕉品種為巴西蕉、寶島蕉和南天黃，由海南各香蕉基地提供。成熟的香蕉果肉通過(guò)攪拌機(jī)處理后，-20 ℃冷凍保藏。

1.1.2 試劑 5-羥色胺、色氨酸、褪黑素標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Sigma公司），甲醇（色譜純）（美國(guó)Fisher公司），無(wú)水乙酸鈉（分析純）（廣州化學(xué)試劑廠），HLB填料、WCX填料、多壁碳納米材料（MWCNTs）。

1.2.3 儀器 Waters Alliance e2695型高效液相色譜儀（配有2489紫外檢測(cè)器） （美國(guó)Waters公司），Milli-Q Advantage A10超純水系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博公司），Centrifuge CR22N冷凍離心機(jī)（日本HITACHI公司），UMV-2多管漩渦混合器（北京優(yōu)晟聯(lián)合科技有限公司），T18高速均質(zhì)機(jī)（德國(guó)IKA集團(tuán)），超聲波清洗儀，萬(wàn)分之一天平（日本SHIMAZU公司）。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取5-羥色胺、色氨酸、褪黑素各10 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻，制備成100 mg/L的儲(chǔ)備液備用。分別取以上標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，用甲醇配制成終濃度分別為0.25、0.5、1、2.5、5 mg/L的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.2.2 色譜條件 參考宋吉英的條件[16]，色譜柱：Waters SunFire? C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L乙酸鈉水溶液（A）-甲醇（B）梯度洗脫，梯度洗脫程序?yàn)椋?5%A-5%B平衡色譜柱，0～30 min，A（%）：95→10，B（%）：5→90；30～31 min，A（%）：10→95，B（%）：90→5，保持5 min；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)275 nm；進(jìn)樣體積10 μL。

1.2.3 樣品處理 準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g香蕉，均質(zhì)，加入30 mL甲醇，以2 500 r/min的轉(zhuǎn)速漩渦提取5 min，使目標(biāo)物質(zhì)充分浸出，10 000 r/min離心3 min，上清液轉(zhuǎn)入50 mL棕色容量瓶中，殘?jiān)儆?5 mL甲醇按上述步驟重復(fù)提取1次，合并2次提取液，用甲醇定容至50 mL備用。吸取2 mL提取液，加入0.02 g多壁碳納米材料（MWCNTs），漩渦使提取液得到充分凈化，10 000 r/min離心3 min，提取液經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾到進(jìn)樣瓶中，待測(cè)。

1.2.4 添加回收試驗(yàn) 在香蕉樣品中添加一定體積的5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.2.3的方法提取、凈化，按1.2.2條件測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。設(shè)3個(gè)不同水平質(zhì)量濃度，每個(gè)添加濃度重復(fù)6次。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶劑及料液比的選擇

比較了甲醇、甲醇-水（1：1，V/V）、水作提取溶劑對(duì)香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素提取效率的影響。結(jié)果表明，甲醇作為提取溶劑效果最佳，詳見(jiàn)表1。

確定提取溶劑為甲醇，選擇料液比為2：5、1：5、1：7、1：10、1：15，對(duì)香蕉進(jìn)行提取試驗(yàn)。從圖1可以看出，提取效率隨料液比加大而增加。料液比為1：10時(shí)，5-羥色胺、色氨酸、褪黑素的回收率分別為95.6%、95.8%、90.0%。當(dāng)料液比繼續(xù)增大時(shí)，提取效率增幅不明顯。因此，料液比確定為1：10。

2.2 提取方式的選擇

比較了超聲、漩渦、均質(zhì)3種提取方式對(duì)香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素提取效率的影響。結(jié)果表明，與超聲提取相比，漩渦提取和均質(zhì)提取3種目標(biāo)物質(zhì)的回收率更好，詳見(jiàn)表2?？紤]到多管漩渦混合器操作簡(jiǎn)單，能同時(shí)處理多份樣品節(jié)省操作時(shí)間，因此選擇漩渦提取。

2.3 凈化方法優(yōu)化

比較了WCX、HLB、MWCNTs三種凈化材料對(duì)香蕉提取液的凈化效果。由圖2可知，3種填料對(duì)香蕉提取液都有一定凈化效果，但是使用HLB填料凈化，樣品中色氨酸和褪黑素大部分被吸附；使用WCX填料凈化，樣品中5-羥色胺幾乎都被吸附；而使用MWCNTs凈化，凈化效果好且3種目標(biāo)物質(zhì)回收率均符合要求。故選擇MWCNTs為凈化材料，進(jìn)一步比較MWCNTs不同用量對(duì)目標(biāo)物質(zhì)凈化效果的影響。由圖3可知，用量分別為0.01、0.02、0.03、0.04 g時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)的回收率均高于80%；用量為0.05 g時(shí)，目標(biāo)物質(zhì)的回收率下降至70%以下。鑒于用量為0.02、0.03、0.04 g時(shí)的凈化效果優(yōu)于用量為0.01 g時(shí)的，同時(shí)為了節(jié)約成本，最終選擇添加0.02 g MWCNTs凈化樣品。

2.4 線性范圍考察

將質(zhì)量濃度為0.25、0.5、1、2.5、5 mg/L的3種胺類(lèi)物質(zhì)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行HPLC分析（表3），對(duì)各測(cè)得值進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析和線性回歸分析。結(jié)果表明：在該濃度范圍內(nèi)，3種目標(biāo)物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)都在0.99以上，而且香蕉樣品上機(jī)溶液濃度也在該濃度范圍內(nèi)，說(shuō)明該線性范圍符合香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素含量的測(cè)定。

2.5 準(zhǔn)確度和精密度

香蕉中添加5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。從表4可知，5-羥色胺的3個(gè)添加水平的回收率為74.0%～82.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.18%～2.19%；色氨酸的3個(gè)添加水平的回收率為82.8%～95.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.86%～1.55%；褪黑素的3個(gè)添加水平的回收率為93.5%～110%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.53%～3.99%?；厥章室约跋鄬?duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均能滿(mǎn)足分析要求，說(shuō)明該方法能滿(mǎn)足分析要求。

2.6 香蕉樣品的測(cè)定

3個(gè)品種香蕉果肉中的5-羥色胺含量在3.76～17.5 mg/kg之間，色氨酸含量在7.76～43.6 mg/kg之間。其中巴西蕉果肉中色氨酸含量略高于南天黃和寶島蕉，最高能達(dá)到43.6 mg/kg。3個(gè)品種的香蕉果肉中均未檢出褪黑素。標(biāo)準(zhǔn)溶液和香蕉樣品的色譜圖見(jiàn)圖4。

3 討論

本研究中，甲醇作為提取溶劑效果最佳，推測(cè)原因可能有二：一是5-羥色胺、色氨酸、褪黑素的極性較小，具有較高親脂性，在甲醇中的溶解度大；二是香蕉的含糖量高，同時(shí)含有少量蛋白質(zhì)，這兩種物質(zhì)均易溶于水，不溶于甲醇。根據(jù)相似相溶原則，選擇甲醇作為提取溶劑，能減少雜質(zhì)干擾，提高胺類(lèi)物質(zhì)萃取效率。

超聲波提取法被廣泛應(yīng)用于提取植物中的活性物質(zhì)，劉定等[15]利用超聲波提取芍藥中褪黑素并用HPLC-MS/MS對(duì)其含量進(jìn)行分析測(cè)定，平均回收率為70.06%；陳晨等[17]利用超聲波提取香蕉皮中多酚，提取率為2.931%。本實(shí)驗(yàn)比較了超聲、漩渦、均質(zhì)3種提取方式對(duì)香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素提取效率的影響，結(jié)果表明漩渦提取和均質(zhì)提取3種目標(biāo)物質(zhì)的回收率更好。這可能是因?yàn)橄憬逗橇扛?，黏稠度大，?jīng)超聲提取的樣品在溶劑中分散效果不好，導(dǎo)致樣品未能與溶劑充分混合，影響目標(biāo)物質(zhì)的回收率。比較漩渦和均質(zhì)兩種方法，漩渦提取回收率略高于均質(zhì)提取，且多管漩渦混合器操作簡(jiǎn)單，能同時(shí)處理多份樣品節(jié)省操作時(shí)間，因此漩渦提取法適合提取香蕉中胺類(lèi)物質(zhì)。

由于香蕉中胺類(lèi)物質(zhì)含量較低，且樣品中含有多糖、酚類(lèi)等物質(zhì)干擾分析，需要對(duì)樣品進(jìn)行凈化處理，以減少基質(zhì)干擾，從而提高檢測(cè)靈敏度。最常用的凈化方法是固相萃取。王金英等[13]采用C18小柱對(duì)玉米、水稻進(jìn)行凈化處理，測(cè)得褪黑素的平均回收率為94.11%；米娟等[18]采用Sep-pak C18柱對(duì)植物擬南芥進(jìn)行凈化處理，測(cè)得吲哚乙酸的回收率在90.9%～100.9%之間。但固相萃取操作繁瑣，溶劑消耗量大，且樣品轉(zhuǎn)移導(dǎo)致目標(biāo)物質(zhì)損失，影響回收率。近年來(lái)分散固相微萃取技術(shù)發(fā)展迅速，因其操作簡(jiǎn)便快速的優(yōu)勢(shì)而被廣泛用于植物中農(nóng)藥分析。本實(shí)驗(yàn)比較了WCX、HLB、MWCNTs

3種凈化材料對(duì)香蕉提取液的凈化效果，結(jié)果表明MWCNTs凈化效果好且3種目標(biāo)物質(zhì)回收率均符合要求，原因分析：HLB填料中親脂性二乙烯基苯保留非極性化合物，色氨酸和褪黑素可能被二乙烯基苯吸附；WCX填料是經(jīng)過(guò)羧基修飾的離子交換型吸附劑，5-羥色胺可能與羧基發(fā)生離子交換而被吸附；MWCNTs具有特殊的納米級(jí)孔隙結(jié)構(gòu)，比表面積大，能吸附金屬離子、酚類(lèi)、酯類(lèi)等物質(zhì)，但是對(duì)胺類(lèi)物質(zhì)吸附性小，與固相萃取小柱凈化效果相當(dāng)，且目標(biāo)物質(zhì)回收率更高。因此MWCNTs適合作為凈化吸附劑用于分析香蕉中胺類(lèi)物質(zhì)。

本研究用甲醇作為提取溶劑，渦旋混合可快速提取香蕉果肉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素，提取效率高；用MWCNTs可以有效凈化香蕉樣品，通過(guò)回收率試驗(yàn)證明，該方法準(zhǔn)確度、精密度好，能滿(mǎn)足香蕉中5-羥色胺、色氨酸和褪黑素的含量測(cè)定。

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