李源 步偉洋 魯國(guó)東 齊堯堯

摘 要 Rab蛋白作為分子開(kāi)關(guān)，調(diào)控著絲狀真菌中囊泡運(yùn)輸?shù)母鱾€(gè)過(guò)程。為明確禾谷炭疽菌（Colletotrichum graminicola）中Rab蛋白家族成員的數(shù)量和理化特征，本研究利用生物信息學(xué)的方法對(duì)禾谷炭疽菌中的Rab蛋白進(jìn)行比對(duì)搜索，并對(duì)得到的Rab蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)和系統(tǒng)進(jìn)化分析，以期望為進(jìn)一步闡明其功能提供理論指導(dǎo)。結(jié)果表明，禾谷炭疽菌中共有10個(gè)Rab蛋白候選基因，都編碼小分子的親水蛋白，編碼產(chǎn)物都定位于胞內(nèi)具有膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞器上，其中有一半為穩(wěn)定蛋白。此外，該Rab蛋白家族的絕大多數(shù)成員在絲狀真菌中的進(jìn)化是保守的，都具有保守的結(jié)構(gòu)域，但是該家族個(gè)別成員與同屬的黃瓜炭疽菌（Colletotrichum orbiculare）中的同源蛋白的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，暗示了禾谷炭疽菌為了適應(yīng)環(huán)境和更好地侵染植物進(jìn)化出了可能具有特異性功能的Rab蛋白。本研究的結(jié)果將為深入明確Rab蛋白家族的具體功能奠定基礎(chǔ)，期望為進(jìn)一步設(shè)計(jì)更加合理有效的玉米炭疽病防治策略提供新思路。

關(guān)鍵詞 禾谷炭疽菌；Rab蛋白；進(jìn)化分析；保守結(jié)構(gòu)域

中圖分類(lèi)號(hào) S432.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Rab proteins regulate the intracellular vesicle trafficking events in filamentous fungi as molecular switches. In order to clarify the quantity and the physical and chemical characteristics of Rab family proteins in Colletotrichum graminicola， ten candidate Rab proteins were identified from the genome of C. graminicola by bioinformatic approach， the physical and chemical properties and phylogenetic relationship were analyzed， aimed to provide a theoretical guidance for further clarifying the functions. The results showed that all the proteins were small molecule hydrophilic proteins， located in the intracellular membrane-bound organelles and half of them were stable proteins. In addition， most of Rab proteins in C. graminicola were evolutionarily and structurally conserved among filamentous fungi， but individual members possessed relatively far phylogenetic relationship when compared with homologs in Colletotrichum orbiculare， suggesting that some Rab proteins in C. graminicola might have evolved specific functions in order to better adapt to the environment and infect plants. The study would lead to a better understanding of the exact functions of Rab proteins in C. graminicola， which woulod further provide new insights into design better strategies to control maize anthracnose.

Keywords Colletotrichum graminicola； Rab proteins； phylogenetic analysis； conserved domain

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.023

玉米炭疽病在我國(guó)各玉米種植區(qū)普遍發(fā)生，其病原菌為半活體寄生菌禾谷炭疽菌（Colleto?tri?chum graminicola），該菌可以侵染玉米的葉片、莖稈和根部，引起炭疽病、葉枯病和莖腐病，在病部產(chǎn)生近梭形褐色病斑，造成嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失，成為玉米種植業(yè)發(fā)展的瓶頸[1-2]。培育抗病品種和化學(xué)防治是目前防治玉米炭疽病最經(jīng)濟(jì)有效的方法，但該病原菌致病的調(diào)控機(jī)理尚未清晰，而化學(xué)防治容易產(chǎn)生抗藥性并對(duì)環(huán)境造成污染，使得開(kāi)辟持久有效地防治新策略成為目前研究禾谷炭疽菌的熱門(mén)課題。目前結(jié)合快速發(fā)展的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、功能基因組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)[3-5]，從遺傳學(xué)的角度來(lái)分析參與病原菌生長(zhǎng)發(fā)育和侵染致病的胞吞胞吐途徑及其核心調(diào)控蛋白R(shí)ab蛋白，期望在弄清禾谷炭疽菌蛋白分泌、運(yùn)輸?shù)幕A(chǔ)上，設(shè)法干擾或中斷某些重要蛋白的關(guān)鍵靶位點(diǎn)的表達(dá)抑制病原菌的侵入或提高玉米的防衛(wèi)反應(yīng)，從而降低玉米炭疽病的流行速率，進(jìn)而達(dá)到防控病害的目的。

Rab蛋白家族是Ras超家族中最大的亞家族，存在于真核細(xì)胞幾乎所有與膜相關(guān)的細(xì)胞器中，調(diào)控著胞吞、胞吐和貨物循環(huán)等過(guò)程[6]。Rab蛋白大小為22～27 ku，含有高度可變的N末端和C末端以及保守的G結(jié)構(gòu)域，其中G結(jié)構(gòu)域包含了5個(gè)α螺旋、6個(gè)β折疊和2個(gè)分子開(kāi)關(guān)[7]。每一個(gè)Rab都能靶定到一個(gè)特異的細(xì)胞器上，通過(guò)其上游調(diào)控因子和下游特定的效應(yīng)子的輔助，實(shí)現(xiàn)活性態(tài)GTP結(jié)合形式和失活態(tài)GDP結(jié)合形式的循環(huán)，進(jìn)而調(diào)控著囊泡運(yùn)輸?shù)母鱾€(gè)過(guò)程。研究表明Rab蛋白在進(jìn)化過(guò)程中是高度保守的，盡管其數(shù)目在不同生物中差別很大，例如，哺乳動(dòng)物和擬南芥中Rab蛋白的數(shù)量至少60個(gè)[8-9]，而真菌中其數(shù)目8～12個(gè)不等[6]，但是Rab家族可以劃分為6個(gè)亞家族，且每個(gè)亞家族大多與某一個(gè)特定的過(guò)程相關(guān)[9]：Group I（分泌過(guò)程：Rab1/Rab8/ Rab18）、Group II（早期內(nèi)涵體：Rab5/Rab21/ Rab22/Rab24/RabX1）、Group III（晚期內(nèi)含體：Rab7/Rab23/Rab29/Rab32/Rab7L1）、Group IV（內(nèi)涵體到膜表面的循環(huán)：Rab2/Rab4/ Rab11/Rab14）、Group V（內(nèi)涵體到高爾基的循環(huán)：Rab6）以及Group VI（纖毛或鞭毛相關(guān)運(yùn)輸過(guò)程：Rab28/ RabL4）[10]。

研究顯示，Rab蛋白不僅在囊泡運(yùn)輸中發(fā)揮作用，其功能也延伸到信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、自噬等過(guò)程[6-7，11]。近幾年像構(gòu)巢曲霉[12-15]、玉米黑粉菌[16]、稻瘟病菌[17-18]、禾谷鐮刀菌[19]等絲狀真菌中已有關(guān)于Rab蛋白的相關(guān)報(bào)道，然而在禾谷炭疽菌中尚無(wú)Rab蛋白家族的報(bào)道。鑒于此，本研究擬利用生物信息學(xué)的方法鑒定禾谷炭疽菌調(diào)控胞吞胞吐途徑的核心蛋白R(shí)ab家族蛋白，并深入分析和預(yù)測(cè)其進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域，以期對(duì)詮釋Rab蛋白的生物學(xué)功能提供理論指導(dǎo)，為進(jìn)一步闡明禾谷炭疽菌的致病機(jī)理和尋找玉米炭疽病的防控新方法指明方向。

1 材料與方法

1.1 材料

首先，將已報(bào)道的釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中Ypt蛋白的氨基酸序列作為種子序列，在禾谷炭疽菌基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//fungi. ensembl.org/Colletotrichum_graminicola/Info/Index）中進(jìn)行BLASTP比對(duì)搜索，參數(shù)設(shè)置為默認(rèn)值，獲得同源蛋白。其次，為保證候選基因的準(zhǔn)確性和無(wú)遺漏，再利用已報(bào)道的Rab蛋白預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rabdb.org/browser/）搜索禾谷炭疽菌中的Rab蛋白。最后，將兩種方法獲得的Rab候選蛋白進(jìn)行比較分析，結(jié)合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的Rab蛋白，最終確定禾谷炭疽病菌中Rab蛋白的數(shù)量、基因號(hào)、序列等信息，并對(duì)其進(jìn)行重新命名。

1.2 方法

1.2.1 禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的理化性質(zhì)分析 將獲得的禾谷炭疽菌Rab蛋白家族的氨基酸序列分別導(dǎo)入在線(xiàn)生物信息學(xué)軟件ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）中，分析該蛋白家族的理論分子量、等電點(diǎn)、半衰期、不穩(wěn)定指數(shù)和親水性特征。而亞細(xì)胞定位則是通過(guò)ProtComp 9.0（http：//www.softberry.com/berry. phtml？topic=protcompan&group=programs&subgroup=proloc）在線(xiàn)軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)分析獲得。

1.2.2 禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族在絲狀真菌中的系統(tǒng)進(jìn)化分析 搜索已發(fā)表的Broad institute數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.broadinstitute.org/annotation/ genome/）和已報(bào)道的Rab蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得釀酒酵母（S. cerevisiae）、稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、禾谷鐮刀菌（Fusarium graminearum）、黃瓜炭疽病菌（Colletotrichum orbiculare）6種真菌中Rab蛋白的同源蛋白序列。首先利用MEME6.0軟件中的Clustal W應(yīng)用對(duì)7種真菌的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析，其中多重序列比對(duì)空格罰設(shè)置為10，空格擴(kuò)展罰設(shè)置為0.2。然后利用MEGA6.0軟件將比對(duì)好的序列使用鄰接法（neighbor joining）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，采用泊松校正，成對(duì)刪除和1 000次重復(fù)抽樣檢驗(yàn)bootstrap值等建樹(shù)參數(shù)。最后對(duì)獲得的進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行顏色設(shè)置及人工標(biāo)注。

1.2.3 禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系及基因組結(jié)構(gòu)分析 根據(jù)上述方法構(gòu)建禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的進(jìn)化樹(shù)，而禾谷炭疽菌中編碼Rab蛋白的基因的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)則通過(guò)將所有基因的DNA和CDS序列導(dǎo)入GSDS網(wǎng)站（http：// gsds1.cbi.pku.edu.cn/）來(lái)獲得。

1.2.4 禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域分析 首先將禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的氨基酸序列導(dǎo)入Clustal X 1.83軟件進(jìn)行多重比對(duì)，然后利用在線(xiàn)著色網(wǎng)站BoxShade（http：//www.ch. embnet.org/software/BOX_form. html）對(duì)同源序列進(jìn)行著色，最后參考已報(bào)道的Rab蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，對(duì)禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行人工標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族的鑒定及注釋

通過(guò)查找、序列比對(duì)并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，最終鑒定出禾谷炭疽菌中共含有10個(gè)Rab蛋白候選基因，對(duì)其重新命名如表1所示。禾谷炭疽菌中10個(gè)Rab蛋白基因的開(kāi)放閱讀框長(zhǎng)度都在1 000 bp以下（609～999 bp），編碼202～332 aa。

進(jìn)一步對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)（表2），這些Rab蛋白的分子量介于22.32～35.56 ku，等電點(diǎn)在4.87～9.17之間。其中被預(yù)測(cè)的不穩(wěn)定指數(shù)小于40的為穩(wěn)定蛋白，而高于40的則為不穩(wěn)定蛋白，因此禾谷炭疽菌中Rab蛋白家族一半預(yù)測(cè)為穩(wěn)定蛋白（CgRab1、CgRab5A、CgRab5B、CgRab6、CgRab11），而另一半則為不穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水性（grand average of hydropathy，GRAVY）是指所有氨基酸親水值的總和與氨基酸個(gè)數(shù)之間的比值，負(fù)值代表親水性，負(fù)值越大表明親水性越強(qiáng)，而正值代表疏水性，正值越大則表明疏水性越強(qiáng)，因此所有的CgRabs 都屬于小分子量親水蛋白，其中CgRab2的親水性最高，而CgRab11的親水性最小。而亞細(xì)胞定位分析（表2）表明，禾谷炭疽菌中的所有Rab蛋白都定位于胞內(nèi)具有細(xì)胞膜的細(xì)胞器上，CgRab1主要定位于質(zhì)膜（plasma membrane），CgRab4分布于線(xiàn)粒體（mitochondrial），CgYpt7則集中在液泡（Vacuolar）上，其余CgRabs蛋白都定位于高爾基（Golgi）上。此外，該Rab蛋白所有成員均無(wú)信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域（結(jié)果未列出）。