梁曉 伍春玲 陳青 徐雪蓮

摘 要 昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450的CYP4家族基因是在殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)表達(dá)和抗藥性研究方面涉及最多的基因家族之一。擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑是防治赤擬谷盜的常用藥劑，當(dāng)前已有較多抗藥性相關(guān)報(bào)道，但尚缺乏多個(gè)擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥對(duì)赤擬谷盜CYP4家族P450基因誘導(dǎo)表達(dá)特性的研究。本研究首先選取4個(gè)赤擬谷盜CYP4家族P450基因CYP4G7、CYP4G14、CYP4BR1和CYP4BR3，然后用氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分別以不同濃度和時(shí)間處理20 d幼蟲(chóng)，并采用熒光定量PCR分析P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)特性。結(jié)果表明，4個(gè)P450候選基因中僅有CYP4G7不僅可以被供試的3種菊酯類藥劑顯著誘導(dǎo)，并且LC20處理24 h和1/4 LC20處理6 h兩種處理濃度對(duì)CYP4G7的誘導(dǎo)水平無(wú)顯著差異。本研究結(jié)果表明亞致死劑量擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑6 h處理即可導(dǎo)致赤擬谷盜CYP4家族P450基因表達(dá)量的顯著提高，為延緩上述3種殺蟲(chóng)劑抗藥性合理防治赤擬谷盜提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥；赤擬谷盜；P450基因；CYP4家族；誘導(dǎo)特性

中圖分類號(hào) S433.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract Cytochrome P450 gene from CYP4 family is one of the most important gene family which is related to xenobiotic-triggered induction and insecticide resistance. Pyrethroids are the common insecticides applied in the control of the red flour beetle， Tribolium castaneum， and there are several resistance cases reported up to now. However， there are lack of studies regarding the induction of P450 genes from CYP4 family in T. castaneum when treated by different pyrethroid insecticides. In this study， four P450 genes CYP4G7， CYP4G14， CYP4BR1 and CYP4BR3 from 20-d larvae were selected as the candidate genes for the analysis of the transcription when treated by cypermethrin， lambda-cyhalothrin and permethrin respectively. The results showed that among the candidate P450 genes only CYP4G7 could be significantly induced by all the pyrethroids， moreover， the transcription of CYP4G7 under treatment of LC20 for 24 h showed no significant difference when compared to the treatment of 1/4 LC20 for 6 h. The study demonstrated that the induction of CYP4G7 was rapid and only required subletheal concentrations， which could provide a theoretical basis for T. castaneum control and delay the development of resistance to those three pyrethroid insecticides.

Keywords pyrethroid insecticides； Tribolium castaneum； cytochrome P450； CYP4 family； induction pattern

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.021

隨著擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑在害蟲(chóng)防治中的廣泛應(yīng)用，害蟲(chóng)對(duì)此類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的報(bào)道越來(lái)越多，其中以代謝抗性機(jī)制的研究較為普遍。昆蟲(chóng)體內(nèi)細(xì)胞色素P450酶（P450s）、羧酸酯酶（CarE）及谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GSTs）這3類解毒酶的活性及相關(guān)基因表達(dá)量的異常變化是昆蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生代謝抗性的主要原因[1]，這3類解毒基因又以P450s家族類型最多，數(shù)量最為龐大。近年來(lái)許多研究表明，僅僅單個(gè)P450基因的表達(dá)量顯著升高就可導(dǎo)致害蟲(chóng)對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥的抗性的顯著增加，例如，抗溴氰菊酯油菜花露尾甲（Meligethes aeneus）幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)體內(nèi)CYP6BQ23表達(dá)水平比敏感品系提高多達(dá)900倍[2]；抗溴氰菊酯赤擬谷盜體內(nèi)CYP6BQ9基因表達(dá)水平比敏感品系提高200多倍[3]；CYP6P4?[4]、CYP6P12[5]、CYP6Z1[6]和CYP9A[7]的過(guò)表達(dá)是阿拉伯按蚊（Anopheles arabiensis）、白紋伊紋（Aedes albopictus）、不吉按蚊（Anopheles funestus）、東亞飛蝗（Locusta migratoria）對(duì)擬除蟲(chóng)菊酯殺蟲(chóng)劑產(chǎn)生抗性的重要原因。

赤擬谷盜[Tribolium castaneum （Georgia）]是為害嚴(yán)重的世界性儲(chǔ)糧害蟲(chóng)[8-9]，擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥依然是赤擬谷盜藥劑防治過(guò)程中使用較多的殺蟲(chóng)劑類型。研究表明，擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥處理可以誘導(dǎo)害蟲(chóng)多個(gè)P450基因表達(dá)水平的顯著提高[10]，并且與P450s相關(guān)的擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥代謝抗性機(jī)理，也往往涉及來(lái)自不同家族的多個(gè)P450基因[11]。當(dāng)前關(guān)于P450s誘導(dǎo)表達(dá)或抗性相關(guān)研究中，CYP4家族是報(bào)道較多的基因家族，該家族P450基因在擬除蟲(chóng)菊酯脅迫下的誘導(dǎo)表達(dá)在德國(guó)小蠊[12]、埃及伊蚊[10]、致倦庫(kù)蚊[13]、棉鈴蟲(chóng)[14]等害蟲(chóng)研究中得到闡釋。然而一方面，國(guó)內(nèi)外尚缺乏同類藥劑不同品種處理下害蟲(chóng)P450基因誘導(dǎo)表達(dá)的相關(guān)報(bào)道；另一方面，當(dāng)前菊酯類殺蟲(chóng)劑處理下赤擬谷盜CYP4家族基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況尚不清楚。因此，本研究首先通過(guò)生物信息學(xué)分析從赤擬谷盜CYP4家族所有P450基因中選取若干個(gè)可能被誘導(dǎo)的候選基因，然后通過(guò)不同菊酯類農(nóng)藥處理確定能夠被誘導(dǎo)的基因，并進(jìn)一步分析不同濃度，不同時(shí)間處理下這些P450基因的誘導(dǎo)模式，以期為合理使用擬除蟲(chóng)菊酯類殺蟲(chóng)劑防治赤擬谷盜，延緩其抗性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試蟲(chóng)源 赤擬谷盜為堪薩斯州立大學(xué)（Kansas State University）昆蟲(chóng)系實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)的Georgia-1（GA-1）品系。赤擬谷盜飼養(yǎng)參照肖達(dá)[15]的方法進(jìn)行。

1.1.2 供試藥劑 氯氰菊酯（98%）、λ-三氟氯氰菊酯（96.8%）和氯菊酯（97.5%）標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自Chem Service（West Chester，PA）。cDNA第一鏈合成試劑盒，Maxima? SYBR Green qPCR Master Mix試劑盒均為Fermentas公司產(chǎn)品（Fermentas， Glen Burnie，MD）。其他所需緩沖液均按照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第3版）》配制。

1.2 方法

1.2.1 可被不同菊酯類農(nóng)藥誘導(dǎo)的候選P450基因的選擇 選擇赤擬谷盜CYP4家族所有的P450基因，以及其他昆蟲(chóng)來(lái)源的CYP4家族的P450基因（在外源化合物誘導(dǎo)或者抗藥性方面功能已知，具體信息參見(jiàn)表1）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。P450基因氨基酸序列由美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）得來(lái)。不同的P450基因采用Mega 5.0軟件的CLustalW模塊進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，并采用鄰接法（neighbor-joining）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。與其他昆蟲(chóng)功能已知的P450基因聚類于同一分支的赤擬谷盜P450基因?qū)⒆鳛楸徊煌挣ヮ愞r(nóng)藥誘導(dǎo)的候選基因進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 赤擬谷盜的生物測(cè)定方法 將0.5 mL系列濃度的農(nóng)藥（丙酮配制）加入20 mL的玻璃小瓶中，往玻璃小瓶?jī)?nèi)通氮?dú)庵敝帘耆珦]發(fā)（對(duì)照為0.5 mL丙酮）；氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯設(shè)置的濃度梯度均為：CK（0）、0.39、0.78、1.56、3.125、6.25、12.5、25 μg/mL；氯菊酯設(shè)置的濃度梯度為CK（0）、6.25、12.5、25、50、75、100、200 μg/mL；將20 d赤擬谷盜幼蟲(chóng)放入上述用藥處理過(guò)的玻璃瓶中，并于培養(yǎng)箱中飼養(yǎng)24 h（30 ℃，65%濕度），每個(gè)處理濃度（包括對(duì)照）設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭幼蟲(chóng)；記錄各個(gè)處理濃度下的幼蟲(chóng)死亡數(shù)，用SAS 9.1.3進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.3 qRT-PCR測(cè)定方法 赤擬谷盜總RNA的提取參照RNA提取試劑盒進(jìn)行。采用2.0 μg RNA（DNAase去除基因組DNA）用于cDNA的合成。cDNA樣品經(jīng)nuclear-free水稀釋8倍后作為熒光定量PCR的模板。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性15 s，55 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。qPCR的引物設(shè)計(jì)用Beacon Designer 7.0軟件設(shè)計(jì)。內(nèi)參基因采用赤擬谷盜在不同齡期和組織中均穩(wěn)定表達(dá)的ribosomal protein S3（TcRps3）基因來(lái)設(shè)計(jì)[16]。引物信息如表2所示。

1.2.4 擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥對(duì)赤擬谷盜CYP4家族P450s的誘導(dǎo)表達(dá)測(cè)定 以不同菊酯類農(nóng)藥的LC20處理赤擬谷盜20 d幼蟲(chóng)，處理方法同生物測(cè)定，每個(gè)濃度（包括對(duì)照）設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭幼蟲(chóng)。24 h后每個(gè)重復(fù)取存活幼蟲(chóng)4頭提取RNA，通過(guò)qRT-PCR測(cè)定分析候選P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

1.2.5 不同擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥對(duì)赤擬谷盜CYP4家族P450基因的誘導(dǎo)模式 為比較不同處理濃度和處理時(shí)間對(duì)CYP4家族P450基因誘導(dǎo)表達(dá)的影響，同時(shí)減少實(shí)驗(yàn)處理，先以氯氰菊酯為處理藥劑，比較LC20以及1/4 LC20兩個(gè)不同濃度處理時(shí)赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)情況，確定1/4 LC20也能誘導(dǎo)P450s表達(dá)后，再分別比較該濃度處理6、12、24、48 h對(duì)表達(dá)量的影響，確定能夠誘導(dǎo)的最短時(shí)間。隨后將最終確定的氯氰菊酯的濃度設(shè)置方法和時(shí)間分別應(yīng)用于其他菊酯類農(nóng)藥，進(jìn)一步評(píng)價(jià)P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)操作參照生物測(cè)定方法，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)15頭幼蟲(chóng)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

生物測(cè)定時(shí)LC50、LC20、卡方值（χ2）等參數(shù)的計(jì)算采用SAS軟件（SAS 9.1.3，SAS Institute Inc. USA，1996）進(jìn)行。顯著性差異分析采用Students t-test方法以及One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有數(shù)據(jù)均為3個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（ ±SE），顯著性檢測(cè)水平為α=0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥誘導(dǎo)相關(guān)的赤擬谷盜CYP4家族P450基因分析

圖1結(jié)果表明，盡管用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的赤擬谷盜CYP4家族P450基因多達(dá)25個(gè)，但大部分P450基因傾向于在某一個(gè)亞家族內(nèi)聚類（如CYP4B和CYP4Q亞家族），而僅有CY4BR1、CYP4BR3、CYP4G7和CYP4G14這4個(gè)基因能夠與其他昆蟲(chóng)來(lái)源的，在外源化合物誘導(dǎo)和抗藥性方面功能已知的P450基因聚集于同一分支，表明這些基因的相似度較高，在功能上可能也有相似之處，因此最終選擇這4個(gè)P450基因作為候選基因進(jìn)一步研究不同菊酯農(nóng)藥處理時(shí)的誘導(dǎo)表達(dá)情況。

2.2 不同擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥對(duì)赤擬谷盜的毒力

由表3生物測(cè)定結(jié)果可知，赤擬谷盜20 d幼蟲(chóng)對(duì)農(nóng)藥的敏感性順序?yàn)椋悍惹杈挣?氯氰菊酯>氯菊酯，3種藥劑的LC50分別為4.24、7.77、77.46 μg/mL。最終以3種藥劑的LC20測(cè)定分析藥劑處理下赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)情況，具體的處理濃度分別為：三氟氯氰菊酯（2 μg/mL）、氯氰菊酯（2 μg/mL）、氯菊酯（16 μg/mL）。

2.3 不同擬除蟲(chóng)菊酯農(nóng)藥處理對(duì)赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)特性

由圖2可知，氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分別以LC20濃度處理赤擬谷盜20 d幼蟲(chóng)時(shí)，僅有CYP4G7能同時(shí)被供試的3種藥劑顯著誘導(dǎo)（p<0.05），誘導(dǎo)上調(diào)倍數(shù)分別為1.97、1.73和2.00倍，而其余P450基因在藥劑處理前后表達(dá)量并無(wú)顯著差異（p<0.05）。

2.4 擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥對(duì)赤擬谷盜CYP4家族P450基因的誘導(dǎo)模式

圖3結(jié)果表明，LC20和1/4 LC20濃度處理都能夠誘導(dǎo)CYP4G7基因的顯著上調(diào)（p<0.05），

并且表達(dá)量提高倍數(shù)無(wú)顯著差異（p<0.05）。進(jìn)一步比較亞致死劑量，即1/4 LC20（試蟲(chóng)24 h平均死亡率低于5%）處理不同時(shí)間對(duì)CYP4G7表達(dá)量變化趨勢(shì)時(shí)發(fā)現(xiàn)，處理6 h表達(dá)量即可顯著上調(diào)1.92倍，并在處理12 h（2.07倍）和24 h（1.89倍）后仍處在顯著上升水平（p<0.05）；而處理48 h后雖然表達(dá)水平仍高于對(duì)照，但兩者已無(wú)顯著差異（p<0.05）。將上述處理?xiàng)l件（1/4 LC20，6 h）應(yīng)用于所有菊酯農(nóng)藥，結(jié)果表明，對(duì)于任意一種菊酯農(nóng)藥，2種處理方式均可導(dǎo)致CYP4G7表達(dá)量的顯著提高（圖4），并且提高倍數(shù)無(wú)顯著差異（p<0.05）。

3 討論

昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)與藥劑種類密切相關(guān)。首先，不同藥劑誘導(dǎo)的P450基因有顯著差別。例如，沙蠶毒素、二嗪農(nóng)、虱螨脲和環(huán)蟲(chóng)腈處理均不能誘導(dǎo)任何P450基因表達(dá)，DDT僅能夠誘導(dǎo)一個(gè)CYP12D1基因，而苯巴比妥處理可誘導(dǎo)十余個(gè)基因的表達(dá)[25]。其次，同一個(gè)P450基因能夠被不同藥劑誘導(dǎo)。例如，苯巴比妥和咖啡因處理均能顯著誘導(dǎo)果蠅CYP4E2和CYP4E3的表達(dá)[17]，敵敵畏和溴氰菊酯均能夠顯著誘導(dǎo)家蠶CYP4M5基因，生物堿、尼古丁均能顯著誘導(dǎo)煙草天蛾CYP4M1和CYP4M3基因[24]，再次，同種類型結(jié)構(gòu)相似的殺蟲(chóng)劑往往可以誘導(dǎo)相同P450基因的表達(dá)，這在含氰基Ⅱ型擬除蟲(chóng)菊酯類農(nóng)藥（如溴氰菊酯、氯菊酯）對(duì)棉鈴蟲(chóng)[26]、家蠶[27]和岡比亞按蚊[19]P450基因的誘導(dǎo)研究中均得到體現(xiàn)。本研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充了上述理論，候選的4個(gè)P450基因僅有CYP4G7均能夠被上述3種菊酯類農(nóng)藥顯著誘導(dǎo)，其余3個(gè)基因CYP4G14、CYP4BR1和CYP4BR3均不能被任何一種藥劑誘導(dǎo)。然而，必須指出的是，本研究選擇3種菊酯農(nóng)藥是在赤擬谷盜防治中應(yīng)用較多的菊酯農(nóng)藥品種，但該類藥劑種類繁多，結(jié)構(gòu)差異大，因此本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果雖然不能夠完整反映該大類農(nóng)藥所有品種對(duì)赤擬谷盜P450基因的誘導(dǎo)表達(dá)情況，但卻是對(duì)同類型農(nóng)藥誘導(dǎo)害蟲(chóng)P450基因的首次初探。

昆蟲(chóng)細(xì)胞色素P450基因的誘導(dǎo)隨藥劑處理濃度、時(shí)間和昆蟲(chóng)種類而變化。研究發(fā)現(xiàn)用苯巴比妥、咖啡因和DDT分別處理果蠅時(shí)發(fā)現(xiàn)，較低濃度的藥劑處理即可顯著誘導(dǎo)若干個(gè)P450基因的表達(dá)，并且表達(dá)量隨著藥劑處理濃度和時(shí)間的增加而逐漸增強(qiáng)[17]。李婷[28]通過(guò)分析嗜蟲(chóng)書虱的轉(zhuǎn)錄組，發(fā)現(xiàn)多數(shù)P450基因可被溴氰菊酯誘導(dǎo)上調(diào)，表達(dá)高峰多出現(xiàn)在藥劑處理24 h后。針對(duì)小菜蛾的研究發(fā)現(xiàn)氯氰菊酯以亞致死劑量短時(shí)間處理能夠比用高濃度（EC50或LC50）長(zhǎng)時(shí)間處理對(duì)某些P450基因的誘導(dǎo)更顯著，作者認(rèn)為這可能與高濃度氯氰菊酯脅迫降低了害蟲(chóng)的應(yīng)激反應(yīng)能力有關(guān)[29]。劉月慶等[30]也研究發(fā)現(xiàn)溴氰菊酯只能在低劑量范圍內(nèi)（LD10）對(duì)甘藍(lán)夜蛾CYP9A90基因發(fā)揮誘導(dǎo)作用，劑量過(guò)高（LD30和LD50）反而無(wú)誘導(dǎo)效果。相反地，Guo等[31]發(fā)現(xiàn)東亞飛蝗的CYP409A1和CYP408B1均可被不同濃度的（LD10、LD30和LD50）的溴氰菊酯所誘導(dǎo)。相似地，本研究結(jié)果顯示，采用亞致死劑量短時(shí)間處理可以獲得與LC20長(zhǎng)時(shí)間處理相同的誘導(dǎo)效果，說(shuō)明赤擬谷盜CYP4家族這幾個(gè)P450基因可以被不同濃度的氯氰菊酯、氟氯氰菊酯和氯菊酯分別誘導(dǎo)。

研究害蟲(chóng)在殺蟲(chóng)劑脅迫下的誘導(dǎo)模式對(duì)于其抗藥性的預(yù)測(cè)有重要參考價(jià)值。許多研究表明，容易被殺蟲(chóng)劑誘導(dǎo)的P450基因通常與抗性相關(guān)基因同屬一個(gè)基因，這在埃及伊蚊-菊酯類農(nóng)藥（CYP6M11）[32]，小菜蛾-氯菊酯（CYP6BG1）[29]，果蠅-DDT（CYP6G1和CYP12D1）[33]的研究中得到體現(xiàn)。因此，當(dāng)抗藥性產(chǎn)生時(shí)，這些易于被誘導(dǎo)的P450基因可能作為潛在的抗性分子標(biāo)記基因而被優(yōu)先考慮。由于本研究發(fā)現(xiàn)不同的菊酯類農(nóng)藥低濃度處理均可顯著誘導(dǎo)赤擬谷盜CYP4G7的表達(dá)量上調(diào)，因此長(zhǎng)時(shí)間使用不同菊酯類農(nóng)藥防治赤擬谷盜產(chǎn)生交互抗性的風(fēng)險(xiǎn)較大，在實(shí)際生產(chǎn)中應(yīng)注意該類藥劑與其他藥劑的輪換使用，以延緩抗性的產(chǎn)生。

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