桑建偉 陳奕鵬 蔡吉苗 楊揚 徐春華 黃貴修

摘 要 BEB17是分離自健康香蕉根部的具有良好抑菌活性的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。本研究采用直接灌根法，評價了該菌株對4個不同香蕉品種組培杯苗的促生作用和其對香蕉枯萎病菌（Fusarium. oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）的防治效果。結(jié)果表明，經(jīng)BEB17回接后的香蕉杯苗平均株高、葉片數(shù)和鮮重均顯著優(yōu)于對照，其中對南天黃品種的促生效果最好，株高增加48.24%，鮮重增加111.19%；帶菌植株接種Foc4后，香蕉杯苗在發(fā)病率和病情指數(shù)上均顯著低于對照，其中該菌株對南天黃和桂蕉1號的防治效果最明顯，相對防效分別可達(dá)81.51%和77.46%。通過稀釋平板涂布法，觀察其在不同品種香蕉苗的定殖情況，發(fā)現(xiàn)BEB17能穩(wěn)定定殖于4種香蕉品種，其中在南天黃的根部定殖10 d后定殖量最高，達(dá)6.43×104 CFU/g，在桂蕉1號定殖10 d和20 d后莖部和葉部定殖量達(dá)峰值，分別為1.58×103 CFU/g和1.43×103 CFU/g；品種比對發(fā)現(xiàn)菌株BEB17與南天黃和桂蕉1號的親和性較強，定殖數(shù)量呈先升后降趨勢。

關(guān)鍵詞 內(nèi)生細(xì)菌；促生作用；定殖分析；抗病性評價

中圖分類號 S476 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract The strain BEB17 is an endophytic Bacillus amyloliquefaciens isolated from the roots of healthy banana with good antibacterial activity. In this study， the direct root irrigation was used to evaluate the growth promoting effect of the strain on four different banana cartivars and the effect on the control of banana fusarium wilt. The results showed that the average plant height， number of leaves and fresh weight of the banana cup seedings returned by BEB17 were significantly better than those of the control. Among them， the growth promoting effect of the Nantianhuang was the best， the plant height increased 48.24%， and the fresh weight increased 111.19%. After the banana cup seedlings transferred back to the strain BEB17 inoculated with banana fusarium wilt， the incidence and disease index of the banana cup seedlings were significantly lower than those of the control. Among them， the strain BEB17 had the most obvious effect on the control of the Nantianhuang and the Guijiao No.1， and the relative control effect was up to 81.51% and 77.46%. The colonization of different cartivars of banana plants was observed by dilution plate coating method. And we found the strain BEB17 could be stably colonized in the four banana cultivars. Among them， the highest colonization amount reached 6.43×104 CFU/g after 10 days of colonization in the roots of the Nantianhuang， the peak values of the colonization amount reached respectively 1.58×103 CFU/g and 1.43×103 CFU/g after 10 days and 20 days of colonization in the stem and leaf part of Guijiao No.1. The comparison of cartivars showed that strain BEB17 had stronger affinity with the Nantianhuang and the Guijiao No.1， and the number of colonization increased first and then decreased.

Keywords endophytic bacteria； growth promoting； colonization analysis； disease resistance evaluation

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.018

香蕉（Musa spp.）是一種極具營養(yǎng)價值的食用經(jīng)濟(jì)作物，廣泛種植于世界熱帶、亞熱帶地區(qū)，是鮮果貿(mào)易量最大的水果之一[1]。由尖孢鐮刀菌古巴專化型4號生理小種（Fusarium. oxysporum f. sp. cubense race 4， Foc4）引起的香蕉枯萎?。ㄓ址Q巴拿馬?。┦且环N侵染維管束導(dǎo)致香蕉植株枯萎死亡的毀滅性土傳病害，已嚴(yán)重威脅著世界香蕉種植業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[2]。近年來，由于化學(xué)藥劑引起的藥物殘留、環(huán)境污染、破壞生態(tài)平衡等負(fù)面影響而令人擔(dān)憂，從而使得利用有益微生物防治植物病害的研究越來越受到人們的重視。其中作為重要生防微生物資源的芽孢桿菌一直以來都是科研工作者關(guān)注的熱點，解淀粉芽孢桿菌是芽孢桿菌中對植物病害具有重要防治作用的一個種，具有較好的抗逆性、根際定殖能力強、對自然環(huán)境安全、次生代謝產(chǎn)物多樣、抑菌譜廣、易于規(guī)模生產(chǎn)與管理等優(yōu)點，是生物防治的重要微生物資源[3-4]。利用芽孢桿菌防治香蕉枯萎病已有大量研究報道，如朱森林等[5]從香蕉根部分離到的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB33，可產(chǎn)IAA促進(jìn)香蕉植株生長，具有較好的生防潛力。孫正祥等[6]發(fā)現(xiàn)一株地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）C-4，對香蕉枯萎病菌1號、4號小種的抑制率分別達(dá)81.25%和83.75%，盆栽實驗發(fā)現(xiàn)該菌株對香蕉枯萎病具有良好的防效。黃霄等[7]分離鑒定了一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）BM-24，對香蕉枯萎病菌抑制效果達(dá)80%以上。

BEB17是分離自健康香蕉植株根部的一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌。前期研究發(fā)現(xiàn)，該菌株具有較強的廣譜抑菌活性，其產(chǎn)生的多種揮發(fā)性抑菌物質(zhì)、脂肽類化合物和聚酮類化合物等多種抗菌物質(zhì)，能抑制尖孢鐮刀菌Foc4的菌絲生長和孢子萌發(fā)（另文發(fā)表）。本研究通過分析內(nèi)生解淀粉芽胞桿菌BEB17回接后對香蕉杯苗的促生長作用和抗病性評價，并研究其在這4個品種香蕉植株中的定殖情況，從而探究該菌株對香蕉枯萎病的生防潛力，為該菌株的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17、香蕉枯萎病病菌尖孢鐮刀菌古巴?；?號生理小種菌株Foc4均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 供試香蕉品種 桂蕉1號和桂蕉9號均由廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，熱科2號和南天黃均由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。所有供試香蕉苗均選用生長一致的四葉期組培杯苗。

1.1.3 培養(yǎng)基和試劑 LB和PDA培養(yǎng)基參照植病研究方法配制，分別用于細(xì)菌和真菌的培養(yǎng)[8]。真菌孢子懸浮液的制備參照朱森林等[5]方法：利用血球計數(shù)板將孢子懸浮液濃度調(diào)整至2×106 CFU/mL的分生孢子懸浮液備用。gyrB基因引物由華大基因股份有限公司合成，PCR擴(kuò)增反應(yīng)所需Taq酶、dNTP等試劑購于TaKaRa公司，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌BEB17回接不同香蕉品種杯苗的促生作用測定 選取4種不同香蕉品種（熱科2號、桂蕉9號、南天黃、桂蕉1號）沙床苗轉(zhuǎn)入椰糠帶土的杯苗中，除按常規(guī)肥水管理外，每隔10 d直接灌施BEB17菌液，菌液施用量按杯苗容積計算（濃度為1×106 CFU/mL，100 mL/杯），施用等量LB液體培養(yǎng)基為空白對照。施用菌液3次后，分別取施用內(nèi)生菌液和LB液體培養(yǎng)基的不同品種香蕉杯苗各20株，于最后一次接種30 d后用卷尺測定香蕉苗株高，用天平稱量香蕉苗鮮重，并對其新抽生葉片數(shù)進(jìn)行計數(shù)。

1.2.2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌BEB17回接不同香蕉品種杯苗的抗病性評價 BEB17回接不同香蕉品種杯苗方法參照第1.2.1節(jié)。最后一次施用BEB17菌液10 d后，分別各取20株不同處理的香蕉品種杯苗，灌根法接種Foc4孢子懸浮液（濃度為1×106 CFU/mL，100 mL/杯），30 d后調(diào)查植株發(fā)病情況。統(tǒng)計發(fā)病率并參照病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)[9]按以下公式計算病情指數(shù)和相對防效。

發(fā)病率（%）=枯萎病發(fā)病株/實驗有效株×100%

病情指數(shù)=[Σ（各級病株數(shù)×該病級）]/（調(diào)查總株樹×最高病級）×100

相對防效（%）=（對照病情指數(shù)–處理病情指數(shù)）/對照病情指數(shù)×100%

1.2.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌BEB17回接不同香蕉品種杯苗的定殖情況 選取4種不同香蕉品種（熱科2號、桂蕉9號、南天黃、桂蕉1號）沙床苗轉(zhuǎn)入椰糠帶土的杯苗中，采用直接灌根法將濃度為106 CFU/mL的BEB17菌液接種在不同香蕉品種杯苗中，以灌LB液體培養(yǎng)基的植株為空白對照。分別于接種后的5、10、15、20、25、30、35和40 d進(jìn)行內(nèi)生細(xì)菌的再分離，檢測香蕉杯苗葉片、球莖和根部的內(nèi)生細(xì)菌定殖情況。再分離方法采用三步消毒法，分別剪取香蕉苗的根、球莖和葉片組織各0.5 g，使用3.25%次氯酸鈉消毒10 min，再用70%乙醇消毒3 min，然后用滅菌水清洗4次后，置于滅菌研缽中研磨。研磨過程中加少量石英砂，研磨均勻后加入5 mL滅菌水，得到濃度為51稀釋液，再用無菌水梯度稀釋至501、5001和50001。芽孢桿菌在溫度高達(dá)120 ℃環(huán)境下仍能生長，故可采用85 ℃水浴10 min來殺死不含有芽孢的菌種，有助于快速篩選植株體內(nèi)的芽孢桿菌[10]。水浴后吸取100 μL各梯度稀釋液涂布于LB平板上，每個濃度3次重復(fù)，于28 ℃下培養(yǎng)2 d后，統(tǒng)計菌落數(shù)。同時對每個平板隨機挑取2個菌落進(jìn)行g(shù)yrB基因測序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2010和SAS 9.1軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和差異顯著性檢驗。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗內(nèi)生細(xì)菌BEB17回接不同香蕉品種杯苗的促生作用測定

由表1和圖1可見，當(dāng)灌施內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17菌液后，香蕉杯苗的株高、新抽生葉片數(shù)和鮮重均高于對照處理?？傮w來看，該菌株對不同品種香蕉苗形態(tài)指標(biāo)的影響大小依次表現(xiàn)為：南天黃>桂蕉1號>熱科2號>桂蕉9號。其中BEB17對南天黃植株影響最大，株高（31.65 cm）相對于空白處理（21.35 cm）增加了48.24%；鮮重（124.39 g）相對于空白對照（58.90 g）增加了111.19%?？梢夿EB17菌株發(fā)酵液可以促進(jìn)香蕉苗的生長。

2.2 拮抗內(nèi)生細(xì)菌BEB17回接不同香蕉品種杯苗的抗病性評價

由表2可知，接種菌株BEB17后均可提高這4個香蕉品種的相對防效，一定程度上降低了其病情指數(shù)。其中菌株BEB17對南天黃和桂蕉1號的防治效果最明顯，其相對防效分別可達(dá)81.51%和77.46%，降低了發(fā)病率和病情指數(shù)，與未灌菌株BEB17的對照差異達(dá)顯著水平?？傮w來看，該菌株回接不同品種香蕉苗對香蕉枯萎病菌的相對防效影響大小依次表現(xiàn)為：南天黃>桂蕉1號>熱科2號>桂蕉9號。由此可見，BEB17菌株回接不同品種香蕉杯苗對香蕉枯萎病具有很好的防治作用。

2.3 拮抗內(nèi)生細(xì)菌BEB17回接不同香蕉品種杯苗的定殖情況

從圖2可以看出，菌株BEB17處理后，從不同香蕉品種的根、球莖和葉片中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生細(xì)菌BEB17的菌落形態(tài)相似，單菌落呈圓形，邊緣規(guī)則，有隆起，表面褶皺，不透明，表面干燥，菌落呈乳白色；然而對照組（菌株BEB17未處理）的根、球莖和葉片中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌數(shù)量少，菌落形態(tài)差異較大（圖2）。從每個平板中隨機挑取2個菌落進(jìn)行g(shù)yrB基因測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株BEB17處理后，從不同香蕉品種的根、球莖和葉片中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌與內(nèi)生細(xì)菌BEB17的gyrB基因相似性達(dá)100%，而原始菌株BEB17與對照組的根、球莖和葉片中分離的內(nèi)生細(xì)菌gyrB基因差異大（圖3）。說明處理回收的菌株主要是BEB17，而對照分離到的少量菌株不是BEB17。

通過菌株回收分離發(fā)現(xiàn)（圖4），內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17均能在這4個香蕉品種的根、球莖和葉片內(nèi)穩(wěn)定定殖（圖中定殖量的對數(shù)值為零時表示未檢測到芽孢桿菌）。其中，在不同香蕉器官中根部更利于菌株BEB17的定殖，葉片部位次之。

圖4-A顯示，在接種內(nèi)生細(xì)菌后，BEB17可穩(wěn)定定殖于不同品種香蕉苗的根部，定殖量呈先升后降趨勢，其中南天黃和桂蕉9號根部的定殖量在接種后10 d時達(dá)到最大值（6.43×104 CFU/g和4.34×104 CFU/g），熱科2號在接種后20 d時達(dá)到最大值（3.57×104 CFU/g），桂蕉1號在接種后25 d時達(dá)到最大值（2.23×104 CFU/g）；圖4-B顯示，在接種內(nèi)生細(xì)菌后，菌株BEB17在不同品種香蕉苗球莖的定殖量呈起伏狀態(tài)，其中南天黃在接種后5 d球莖的定殖量達(dá)到峰值（2.15×102 CFU/g），在接種后15 d時熱科2號和桂蕉1號的球莖定殖量達(dá)峰值（1.08×102 CFU/g和1.58×103 CFU/g），接種25 d后桂蕉9號球莖定殖量達(dá)峰值（1.32×102 CFU/g）；圖4-C顯示，在不同品種香蕉苗的葉片中內(nèi)生細(xì)菌BEB17可穩(wěn)定定殖，其中熱科2號葉片中的定殖量在接種10 d時達(dá)到最大值（1.34×103 CFU/g），在接種15 d時南天黃和桂蕉9號葉片的定殖量達(dá)到峰值（2.95×102 CFU/g 和1.36×103 CFU/g），在接種20 d時桂蕉1號達(dá)到最大值（1.43× 103 CFU/g）。實驗結(jié)果表明，內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17在不同品種香蕉苗中具有不同的親和性，甚至在不同香蕉器官中的定殖規(guī)律亦存在著顯著差異。

3 討論

芽孢桿菌因其生長速度快、營養(yǎng)需求簡單、抑菌譜廣，具有較好的抗逆性和易于在植物體表面定殖與繁殖等優(yōu)點而被廣泛地應(yīng)用于植物病害的防控以及植物生長的促進(jìn)，因此其已成為生物防治領(lǐng)域研究的熱點之一[4]。目前研究表明，芽孢桿菌對黃瓜、香蕉、棉花、玉米及番茄等多種植物病害都有著明顯的防治效果。高吉坤[11]篩選獲得的枯草芽孢桿菌B29對多種植物病害的致病菌都具有較強抑制作用，其中對黃瓜枯萎病的抗病率可達(dá)到90%以上。謝蘭芬等[12]研究表明，解淀粉芽孢桿菌B9601-Y2對多種病原真菌的孢子萌發(fā)均具有顯著抑制效果，尤其在溫室和田間具有較好的防效。楊曉云等[13]和蔣盼盼等[14]研究發(fā)現(xiàn)解淀粉芽孢桿菌B1619不僅對設(shè)施番茄枯萎病及設(shè)施蔬菜的根結(jié)線蟲病具有較強的防治效果，而且對番茄生長具有顯著促生作用。本研究發(fā)現(xiàn)，解淀粉芽孢桿菌BEB17能夠有效降低南天黃和桂蕉1號這2個品種香蕉枯萎病的發(fā)病率，其相對防效分別可達(dá)81.51%和77.46%；并對不同香蕉品種植株均具有良好的促生長效果，尤其對桂蕉1號和南天黃植株的影響較大，其中對植株鮮重的促生長較為顯著，說明該菌株在促進(jìn)香蕉植株健壯和增重以及提高對香蕉枯萎病抗性具有良好的生防效果。

解淀粉芽孢桿菌大多存在于植株體內(nèi)，因其對多種植物病害具有極好的防治效果和對寄主植物具有較好的促生作用而被開發(fā)成生物肥料等產(chǎn)品已在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中廣泛應(yīng)用。然而在內(nèi)生細(xì)菌的應(yīng)用過程中，能否在植株體內(nèi)有效定殖是其發(fā)揮防控效果的前提和關(guān)鍵因素[15]。目前，在玉米[16-17]、小麥[18]、煙草[19]、山茶[20]等植物上對解淀粉芽孢桿菌的定殖情況均有研究報道。本研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17能夠在不同品種香蕉苗中長期定殖，尤其在桂蕉1號和南天黃品種中大量定殖，其中在香蕉苗的根部組織定殖數(shù)量最多；在其球莖上的定殖數(shù)量較少，難以長期大量定殖；而在葉片上的定殖量比其球莖的較高，可長期定殖，該結(jié)果與前人的報道基本吻合[21-22]。該菌株在不同品種香蕉苗中的定殖數(shù)量存在著差異，其中根部最大定殖量：南天黃>桂蕉9號>熱科2號>桂蕉1號，且南天黃根部定殖量達(dá)到最大值的速度最快，而防效與根部定殖量關(guān)系較大，從初步分析結(jié)果看該菌株與南天黃品種結(jié)合防效效果最好。從定殖結(jié)果來看，該菌株在香蕉苗球莖上定殖效果不佳，其原因可能與不同器官生境不同有關(guān)，BEB17可能對根部和葉片的生存環(huán)境更適應(yīng)。

綜上所述，本研究采用直接灌根法研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌BEB17可以促進(jìn)不同品種香蕉苗的生長，對香蕉枯萎病菌具有良好的防治效果；采用稀釋平板涂布法研究證明該菌株能有效在不同品種香蕉植株中定殖，主要定殖發(fā)生在根部。通過上述研究，為菌株BEB17的定殖特征和生防機制的了解提供了理論基礎(chǔ)，并進(jìn)一步為研究植物-病原菌-內(nèi)生細(xì)菌三者之間的互作關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。但關(guān)于該菌株對大田香蕉植株的促生長和抗性效果不明，回接大田香蕉植株的時效也有待進(jìn)一步研究與摸索。

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