揭應(yīng)碧 盧迎春 宋婉玲 韋坤華 張廣輝 楊生超

摘 要 本研究通過(guò)分析三七（Panax notoginseng）基因組中簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs）位點(diǎn)信息，對(duì)基因組中SSR位點(diǎn)的分布特征進(jìn)行描述，并開(kāi)發(fā)多態(tài)性引物，為評(píng)價(jià)三七遺傳多樣性和群體結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)。利用MISA軟件對(duì)重新組裝的三七基因組進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索，primer3設(shè)計(jì)引物。用隨機(jī)合成的200對(duì)引物，在16個(gè)三七單株中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，來(lái)篩選具有多態(tài)性的引物。在去除冗余序列后組裝得到2.39 Gb大小的三七基因組中總共識(shí)別到314 060個(gè)SSR位點(diǎn)，SSR分布頻率為0.13/kb，其中占主導(dǎo)地位的是二核苷酸重復(fù)基序，占所有重復(fù)基序類型的68.55%，其次是三核苷酸56 250（17.91%）和單核苷酸22 475（7.16%）。在二核苷酸為主的重復(fù)類型中，出現(xiàn)頻率最高的是AT/AT重復(fù)基序占所有二核苷酸重復(fù)的63.66%，最低的是CG/CG重復(fù)基序占0.15%。同時(shí)，在單核苷酸重復(fù)中出現(xiàn)頻率最高的也是A/T重復(fù)類型（79.01%）。經(jīng)過(guò)多態(tài)性篩選最終得到41對(duì)多態(tài)性較好的引物，PIC值范圍為0.11～0.78，平均值為0.46。本研究獲得的大量SSR位點(diǎn)信息為三七全基因組SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)，三七分子標(biāo)記輔助育種以及遺傳多樣性分析提供方便。

關(guān)鍵詞 三七；基因組；SSR；多態(tài)性

中圖分類號(hào) S31 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

Abstract The analysis of simple sequence repeat （simple sequence repeats； SSRs） site information in the genome of P. notoginseng was used to describe the distribution characteristics of genome SSR loci， and to develop polymorphic primers to evaluate the genetic diversity and population structure of P notoginseng. MISA software was used to search for the SSR loci of the assembled genome of P. notoginseng. Primers were designed by Primer3， and 200 pairs of primers randomly synthesized were used to amplify PCR in 16 P. notoginseng plants to screen primers with polymorphism. Totally， 314， 060 SSR loci were identified， with an average distance of 0.13 kb between each loci. A large proportion of the SSRs included di-， tri-and mono- repeat motifs， which accounted for 68.55%， 17.91% and 7.16% of all repeats， respectively. Dinucleotide is the main type of repeated categories， the highest frequency of occurrence was AT/AT which accounted for 63.66% in total di- repeats， whereas the lowest frequency of occurrence was CG/CG （0.15%）. A/T was the most common in mononucleotide repeat （79.01%）. After polymorphic screening， we obtained 41 primers with preferable polymorphic primers. The PIC value was 0.11～0.78， with an average of 0.46. Plenty of the SSR locus information and SSR markers were provided in this research， not only provide valuable resources for the development of SSR markers in P. notoginseng， but also provide convenience for P. notoginseng marker-assisted breeding and genetic diversity analysis.

Keywords Panax notoginseng； genome； SSR； polymorphism

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.014

簡(jiǎn)單重復(fù)序列（simple sequence repeats，SSRs）或微衛(wèi)星標(biāo)記，是由1～6個(gè)核苷酸多次串聯(lián)重復(fù)的DNA序列，是基因組中豐富存在的、均勻分布的共顯性和多等位基因的分子標(biāo)記，而且容易被檢測(cè)[1～4]。這些特性使得SSR標(biāo)記成為植物分子標(biāo)記輔助育種、遺傳資源DNA指紋圖譜分析、圖位克隆基因等研究的重要工具之一。最初，大多數(shù)植物的SSR標(biāo)記主要來(lái)自表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tags，ESTs）和細(xì)菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）序列。近年來(lái)，隨著越來(lái)越多的植物基因組測(cè)序的完成，也從基因組中鑒定了大量SSRs標(biāo)記[5～8]。但是，多集中于模式植物和主要的農(nóng)作物等，其他植物由于缺乏基因組序列，基于基因組的SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)也鮮有報(bào)道。

三七（Panax notoginseng （Burk.） F. H. Chen）為五加科人參屬多年生草本植物，以根及根莖入藥，具有散瘀止血、消腫定痛、防止腦缺血、止血、降脂和保護(hù)肝臟等功效[9-10]。據(jù)考證，三七至少已有400年以上的栽培歷史[11]。但是，幾百年來(lái)，一直沒(méi)有選育出用于推廣種植的品種，生產(chǎn)上長(zhǎng)期使用混雜的種質(zhì)，導(dǎo)致三七遺傳多樣性逐漸喪失[12]，直接影響三七藥材的產(chǎn)量和品質(zhì)，表現(xiàn)為三七植株個(gè)體間表型差異巨大[13]，主要皂苷組分含量也相差3.6～10.2倍[14]。同時(shí)，居群內(nèi)遺傳多樣性豐富，而居群間遺傳分化水平低，遺傳差異主要存在于居群內(nèi)[15-16]。因此，三七新品種選育是生產(chǎn)上亟待解決的關(guān)鍵科學(xué)問(wèn)題之一。

開(kāi)發(fā)有效的分子標(biāo)記是植物育種的重要手段之一。前人曾利用fAFLP（fluorescent amplified fragment length polymorphism）和EST-SSR等對(duì)三七群體的遺傳多樣性進(jìn)行分析[15-16]。楊云[17]利用ISSR（inter-simple sequence repeat）和SRAP（sequence-related amplified polymorphism）對(duì)三七集團(tuán)選擇后代群體進(jìn)行了遺傳一致性分析，并選育了2個(gè)新品種“滇七1號(hào)”和“苗鄉(xiāng)三七1號(hào)”，其中“滇七1號(hào)”的主要特征為莖翠綠色、存苗率高；“苗鄉(xiāng)三七1號(hào)”莖則為紫色，抗性強(qiáng)，皂苷含量高。近年來(lái)，利用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序開(kāi)發(fā)了人參屬植物大量EST-SSR標(biāo)記[18-20]，但EST-SSR的覆蓋度低、不包含非基因非編碼區(qū)，從而限制了其應(yīng)用。

2017年，中藥材課題組率先發(fā)布了三七基因組（包括轉(zhuǎn)錄本），組裝的三七基因組草圖大小為2.39 Gb，contig N50和scaffold N50分別為16 kb和96 kb[21]?；蚪M測(cè)序的完成為三七育種和藥效成分生物合成關(guān)鍵酶基因的發(fā)現(xiàn)提供了基礎(chǔ)。本研究分析比較了三七基因組和轉(zhuǎn)錄組的SSR位點(diǎn)信息差異，利用三七基因組SSR位點(diǎn)開(kāi)發(fā)了大量引物，并隨機(jī)選擇了200對(duì)引物進(jìn)行了多態(tài)性驗(yàn)證，從中篩選出了41對(duì)多態(tài)性引物。本研究為三七SSR標(biāo)記開(kāi)發(fā)提供堅(jiān)實(shí)基礎(chǔ)，也為三七種源遺傳多樣性鑒定等提供了有效的工具。

1 材料與方法

1.1 三七基因組中SSR位點(diǎn)信息的搜索

利用軟件MISA（microsatellite identification tool， http：//pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/）搜索三七基因組中的SSR位點(diǎn)。搜索標(biāo)準(zhǔn)選擇重復(fù)單元為1、2、3、4、5、6個(gè)堿基的基序，最小重復(fù)數(shù)分別為12、6、5、5、4、4。2個(gè)相鄰SSR之間的堿基數(shù)≤100，則被定義為復(fù)合型SSR。為比較轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)和基因組SSR位點(diǎn)差異，本研究下載了三七不同部位轉(zhuǎn)錄組原始測(cè)序reads[19]（NCBI Sequence Read Archive登錄號(hào)為PRJNA228978），混合組裝，并分析其SSR位點(diǎn)（不包含單核苷酸重復(fù)）。

1.2 三七SSR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)SSR位點(diǎn)兩端的保守序列，利用primer3（http：//primer3.sourceforge.net/）設(shè)計(jì)引物，引物長(zhǎng)度20～23 bp，退火溫度60 °C左右；引物中堿基重復(fù)數(shù)小于等于4，引物兩端不能有2個(gè)連續(xù)的A/T堿基；PCR產(chǎn)物大小在150～300 bp。隨機(jī)選擇200對(duì)引物，由昆明碩陽(yáng)科技有限公司合成，以篩選多態(tài)性引物。

1.3 引物多態(tài)性驗(yàn)證

在云南文山市苗鄉(xiāng)三七科技園（文山市硯山縣），隨機(jī)采集16個(gè)單株的新鮮葉片用于多態(tài)性引物篩選，其中自然群體6個(gè)單株、苗鄉(xiāng)三七1號(hào)6個(gè)單株和滇七1號(hào)4個(gè)單株。EasyPure Plant Genomic DNA Kit（北京全式金生物技術(shù)有限公司）提取基因組DNA。引物合成時(shí)在正向引物5′端加M13F通用引物序列（5′-TGTAAAACGA?CGG?CCAGT-3′），第一次PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物帶上M13F序列。選擇第一次PCR中條帶理想的產(chǎn)物進(jìn)行二次擴(kuò)增，用帶有不同顏色且序列和M13F一致的熒光引物（A603012557Hex和A6030125?56?Fam）替換原來(lái)的M13F序列，目的是使得二次擴(kuò)增產(chǎn)物帶有熒光便于檢測(cè)。

第一輪PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為15 ?L，包含7.5 μL mix，正向和反向引物各1.0 μL，基因組DNA 1.0 μL和4.5 μL ddH2O；擴(kuò)增程序94 ℃預(yù)變性5 min，然后進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包含94 ℃變性30 s，最佳退火溫度退火30 s，72 ℃延伸30 s；最后72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物0.8%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板進(jìn)行第二輪PCR擴(kuò)增，15 μL PCR反應(yīng)體系包含7.5 μL mix，1 μL反向引物、一次擴(kuò)增產(chǎn)物1.0 μL、熒光引物1.0 μL和4.5 μL ddH2O。擴(kuò)增程序和一次擴(kuò)增相同，將二次擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行相應(yīng)的稀釋定量，將稀釋后的兩種不同的熒光引物混合加入一個(gè)孔內(nèi)，體積各為0.5 μL，加入10 μL的GS500LIZ組成11 μL反應(yīng)體系，離心，95 ℃變性5 min，–20 ℃冰箱保存。

1.4 數(shù)據(jù)分析

用軟件GeneMapper v4.1對(duì)測(cè)序結(jié)果分析位點(diǎn)多態(tài)性，根據(jù)產(chǎn)生的峰圖確定核心位點(diǎn)片段大小，選擇特異性高、多態(tài)性好的位點(diǎn)峰圖產(chǎn)生的Excel數(shù)據(jù)，POPGENE32計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的等位基因數(shù)、Shannon指數(shù)，軟件PIC CALC計(jì)算每個(gè)標(biāo)記的多態(tài)性信息含量，統(tǒng)計(jì)分析時(shí)將SSR視為共顯性標(biāo)記。

2 結(jié)果與分析

2.1 三七基因組中SSR信息位點(diǎn)的分布特征

三七基因組122 131條scaffold中共包含314 060個(gè)SSR位點(diǎn)，分布于36 763條scaffold上，其中26 500條scaffold含有一個(gè)以上SSR位點(diǎn)，復(fù)合型SSR有46 463個(gè)（表1）。相反，在三七轉(zhuǎn)錄組的45 678條unigenes中，識(shí)別到了4 756個(gè)SSR位點(diǎn)，同樣地，在454測(cè)序的三七根部轉(zhuǎn)錄組的2 361條特異序列中識(shí)別到2 772個(gè)SSR基序。在三七轉(zhuǎn)錄組中每Mb有134.73個(gè)SSR，位點(diǎn)發(fā)生頻率為7.43 kb/SSR。三七基因組每Mb有131.00個(gè)SSR，SSR位點(diǎn)的發(fā)生頻率為7.62 kb/SSR。

三七基因組中，二核苷酸重復(fù)單元占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，占總數(shù)的68.55%；其次是三核苷酸重復(fù)，占總數(shù)的17.91%；同樣，在三七轉(zhuǎn)錄組中，二核甘酸重復(fù)也最多（40.81%），三核苷酸重復(fù)所占比例也很高（36.67%）。在三七根部轉(zhuǎn)錄組中二核苷酸重復(fù)（67.53%）也是最多的，幾乎是三核苷酸重復(fù)（25%）的3倍（表2）。和許多植物基因組相似，三七基因組中較短重復(fù)基序（mono-、di-、tri-）所占比例明顯高于較長(zhǎng)重復(fù)基序（tetra-、penta-、hexa-）所占比例，這一結(jié)果表明在大多數(shù)植物中基序長(zhǎng)度的分布基本一致。從SSR重復(fù)次數(shù)來(lái)看，基因組和轉(zhuǎn)錄組中的SSR位點(diǎn)都是6次重復(fù)最多，分別是11.64%和27.12%；5次重復(fù)和7次重復(fù)的比例也很高。特別地，轉(zhuǎn)錄組中4次重復(fù)的SSR的比例也很高，達(dá)到16.97%（表2），但是不論在基因組還是轉(zhuǎn)錄組中SSR頻率的整體變化規(guī)律是隨著基序長(zhǎng)度的增加而減少。

在單核苷酸重復(fù)中和C/G相比出現(xiàn)數(shù)目最多的是A/T重復(fù)單元，占所有單核苷酸重復(fù)的79.01%。在二核苷酸重復(fù)中出現(xiàn)數(shù)目最多的是AT/AT重復(fù)基序，占所有二核苷酸重復(fù)基序的63.66%；在三七轉(zhuǎn)錄組中除了AT/AT還有AG/CT。三七基因組中二核苷酸重復(fù)類型中數(shù)目最少的是CG/CG，只有330個(gè)，占0.15%。在三七基因組三核苷酸重復(fù)序列中，出現(xiàn)最普遍的重復(fù)類型是AAT/ATT（53.33%）和AAG/CTT（21.91%），出現(xiàn)數(shù)目最少的是ACG/CGT和CCG/CGG，分別只有145和319個(gè)，占所有三核苷酸重復(fù)基序的0.82%（圖1）。然而在三七轉(zhuǎn)錄組的三核苷酸重復(fù)中，AAG/CTT所占比例最高，CCG/CGG和AAC/GTT最少。

2.2 SSR多態(tài)性引物的篩選和驗(yàn)證

本研究隨機(jī)選擇并合成200對(duì)三七引物對(duì)樣本位點(diǎn)進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)，將所有PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳之后用Genemapper v4.1產(chǎn)生的峰圖檢測(cè)樣品位點(diǎn)信息，SSR重復(fù)基序的重復(fù)數(shù)目差異以及短的插入缺失事件形成SSR多態(tài)性，峰圖所顯示的信息是帶有熒光引物的PCR產(chǎn)物在經(jīng)過(guò)毛細(xì)管電泳之后所反饋的產(chǎn)物片段信息。通過(guò)分析每一對(duì)引物在各個(gè)樣品中產(chǎn)生的峰圖顯示的各自特定位點(diǎn)片段大小信息之后，其中有27對(duì)引物的峰圖大小相同不存在差異，有132對(duì)引物沒(méi)有擴(kuò)增出片段，最終得到的有41對(duì)引物的產(chǎn)物符合預(yù)期大小，將這41對(duì)引物峰圖生成Excel數(shù)據(jù)表格，用于計(jì)算引物多態(tài)性信息含量（圖2）。

通過(guò)軟件POPGENE32計(jì)算41對(duì)引物的等位基因觀察值、預(yù)期等位基因數(shù)、Shannon指數(shù)和多態(tài)性信息含量，各個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)目范圍為2～10，平均數(shù)目為3.9。計(jì)算了41對(duì)引物的PIC值，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果發(fā)現(xiàn)16對(duì)引物具有高度多態(tài)性（PIC>0.50），23對(duì)引物具有中度多態(tài)性（0.25

3 討論

SSR具有共顯性、豐富性和高多態(tài)性的特點(diǎn)，并且普遍存在于植物生物基因組中?；诓煌参锘蚪M的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，在擬南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）中平均1.14 kb發(fā)現(xiàn)一個(gè)SSR[22]，在水稻（Oryza sativa L.）中平均3.6 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR[23]，在甘藍(lán)（Brassica oleracea L.）中平均4 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR[24]，在大豆（Glycine max （Linn.） Merr.）中平均4.5 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR[25]，在高粱（Sorghum bicolor （L.） Moench）中平均220 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR[26]，在小麥（Triticum aestivum L.）中平均578 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR[27]。本研究從三七基因組的122 131條序列、總長(zhǎng)度為239 483 436 bp中識(shí)別到314 060個(gè)SSR信息位點(diǎn)，分布在36 763條序列中，SSR的平均密度為每0.13 kb出現(xiàn)一個(gè)SSR。這些結(jié)果可能反映出了存在于植物基因組間的DNA水平的真實(shí)遺傳差異，或者各項(xiàng)研究使用了不同的測(cè)序方法和測(cè)序程序。

三七的基因組中識(shí)別到的SSR基序以二核苷酸為主，占所有識(shí)別到的SSR基序的68.55%，四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸所占比例的總和為6.39%。這一結(jié)果和許多植物中二核苷酸重復(fù)基序在植物基因組中所占比例較高是一致的[28-31]。和許多植物中單核苷酸重復(fù)占主導(dǎo)位置的結(jié)果不同[32]，這一結(jié)果表明SSR在不同物種以及相同物種的不同重復(fù)類型之間是存在差異的。從另一方面講，擁有大量短重復(fù)類型的SSR位點(diǎn)的物種通常表現(xiàn)出較高的基因組突變率[33-35]。

在單核苷酸重復(fù)中A/T基序明顯高于C/G重復(fù)，同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)AT/AT重復(fù)基序是二核苷酸重復(fù)類型中出現(xiàn)頻率最高的，然而CG/GC重復(fù)基序是出現(xiàn)頻率最低的，這一結(jié)果和毛果楊（Populus trichocarpa Torr. & Gray）和落花生（Arachis hypogaea Linn.）中AT/AT重復(fù)基序在二核苷酸中出現(xiàn)頻率最高是一致的[36-37]。許多研究表明，在植物基因組中二核苷酸基序中，（AT）n是最普遍的[37-38]。這一結(jié)果和許多植物基因組中富含AT堿基的重復(fù)類型所占比例高于富含CG的重復(fù)類型是一致的[39-43]。

綜上所述，本研究從三七的基因組中分析得到了豐富的SSR位點(diǎn)信息。對(duì)200對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性篩選后，計(jì)算PIC值范圍是0.06～0.78，平均值為0.46，最終獲得41對(duì)特異性高、多態(tài)性好的引物，多態(tài)性位點(diǎn)獲得率為20.5%。同時(shí)用3種不同居群的三七材料對(duì)篩選的41對(duì)引物進(jìn)行多態(tài)性驗(yàn)證，最終將材料大致分為3類：紫莖、綠莖和對(duì)照。其中部分對(duì)照分別和綠莖、紫莖聚在一起，這可能跟紫莖和綠莖三七是由對(duì)照三七經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培選育所得有關(guān)。因此本研究獲得的引物具有較高的多態(tài)性潛能，可以用于區(qū)分不同居群性狀差異的三七，同時(shí)這些豐富的SSR位點(diǎn)將從基因?qū)用娼沂救呦嚓P(guān)性狀的本質(zhì)，對(duì)進(jìn)一步研究三七的遺傳多樣性、加速三七功能基因資源的開(kāi)發(fā)利用、豐富其分子標(biāo)記類型、遺傳資源評(píng)價(jià)、繪制遺傳圖譜、實(shí)現(xiàn)特定性狀的輔助選擇和進(jìn)行比較基因組學(xué)研究都具有重要的意義。

致謝 感謝提供實(shí)驗(yàn)材料的云南文山苗鄉(xiāng)三七科技園，特此謝意！

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