楊文 蔡澤坪 于旭東 羅佳佳 吳繁花 孟帥良

摘 要 外源施加10–2 mg/L 2，4表油菜素內(nèi)酯（2，4-Epibrassinolide，2，4-eBL）能導(dǎo)致水稻（Oryza sativa L.）初生根發(fā)生不對稱生長形成波浪形彎曲和卷曲。施加高濃度生長素能夠抑制此現(xiàn)象，同時(shí)DR5-GUS結(jié)果表明在發(fā)生不對稱生長的根中，根內(nèi)圈生長素分布較高。本文闡述了外源施加生長素抑制2，4-eBL導(dǎo)致的水稻根不對稱生長現(xiàn)象，為探究油菜素內(nèi)酯與生長素之間的相互關(guān)系提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞 油菜素內(nèi)酯；生長素；水稻；根；不對稱生長

中圖分類號 S59 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A

Abstract Exogenous application of 102 mg/L 2， 4-epibrassinolide（2，4-eBL） resulted in asymmetric growth of Oryza sativa L. primary root， forming wave and coiling. High concentration of auxin could inhibit this phenomenon， DR5-GUS showed that auxin was higher in the inner ring of asymmetric growth roots. 2， 4-epibrassinolide induced asymmetric growth of the root of O. sativa L.， and this could be inhibited by auxin， which a providing theoretical basis for the study of the relationship between brassinolide and auxin.

Keywords brassinolide； auxin； Oryza sativa L.； root； asymmetric growth

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.07.007

油菜素類固醇（brassinosteroids， BRs）在植物界中普遍存在，其結(jié)構(gòu)同動(dòng)物固醇類激素相似，在低于毫摩爾的濃度下發(fā)揮生理作用，被認(rèn)為是第六大植物激素[1-3]。自從1979年Grove等[4]從油菜（Brassica campestris L.）的花粉中分離出油菜素內(nèi)酯（brassinolide， BL）以來，已經(jīng)鑒定出了約70種多羥基甾醇衍生物。BR能參與多種植物的發(fā)育和生理過程，如細(xì)胞伸長、細(xì)胞分裂、木質(zhì)部發(fā)育、應(yīng)激和抗病性等[5]。在這些具有生物活性的BRs中，BL的活性最高[6-7]。外源施加納摩爾至微摩爾的BL能夠影響植物細(xì)胞的伸長、分裂、分化以及組織器官的彎曲生長[7-8]。但BR在植物體各器官中的分布存在顯著差異，尤其在根中的含量甚微，從而導(dǎo)致其在根中的發(fā)現(xiàn)晚于下胚軸及植物體的其他部位。與此對應(yīng)的是，根對BR的反應(yīng)要比植物體的其他部位敏感得多[9]。目前的研究已證明，BR能夠在根中合成并發(fā)揮重要作用，BR能夠影響根長、側(cè)根數(shù)目、不定根形成以及根對重力的感受等[8， 10]。

同時(shí)BR與生長素之間存在著緊密聯(lián)系。生長素可以通過調(diào)節(jié)BR生物合成酶DWARF4（DWF4）和CPD的基因表達(dá)來調(diào)控內(nèi)源BR的含量[11-12]。同時(shí)轉(zhuǎn)錄組分析表明BR途徑能激活大量與生長素相關(guān)的基因表達(dá)[13]。在調(diào)控根生長的過程中，生長素和BR共同控制細(xì)胞分裂、伸長、維管束分化和衰老、根的向地性等[8]。在玉米（Zea mays L.）根部，BR通過增加根對生長素的敏感性來增加向地性，且使用生長素運(yùn)輸抑制劑2，3，5-三碘苯甲酸（TIBA）可以消除這種響應(yīng)[14]。BR也參與調(diào)控?cái)M南芥（Arabidopsis）根的向地性生長，外源施加BR刺激ROP2的活性，從而改變內(nèi)源生長素的分布，導(dǎo)致根向地性增強(qiáng)[15-16]。同時(shí)，BR與生長素相互拮抗，通過維持干細(xì)胞穩(wěn)態(tài)、調(diào)控細(xì)胞分裂和分化，共同維護(hù)根的正常生長[17-18]。本研究以外援施加高濃度生長素打破內(nèi)源生長素不對稱分布作為切入點(diǎn)，闡述了外源施加2，4表油菜素內(nèi)酯（2，4-epibras?sinolide，2，4-eBL）導(dǎo)致水稻根不對稱生長的現(xiàn)象及在此過程中與生長素之間的關(guān)系，為BR與生長素的研究提供新的見解。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻種子為“準(zhǔn)兩優(yōu)2號”由國家雜交水稻研究中心清華深圳龍崗研究所用準(zhǔn)SxR402 雜交選配選育而成。2，4-eBL（code E-1641）購自Sigma公司，用75%乙醇溶解并配置成0.04 mg/mL母液，吲哚-3-乙酸（IAA）和2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）用50%乙醇溶解并配置成1 mg/mL母液，均于4 ℃保存。

1.2 方法

1.2.1 水稻種子滅菌及催芽 挑選穎果不開裂且飽滿的種粒500顆為一組置于小培養(yǎng)皿中，用75%乙醇滅菌1 min后用自來水沖洗8～12遍，置于一次性小培養(yǎng)皿中并加入少量自來水，在培養(yǎng)間條件下催芽2 d。挑選萌發(fā)一致的水稻用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 外源施加2，4-eBL導(dǎo)致水稻初生根不對稱生長 用自來水配制終濃度分別為0、10–1、10–2、10–3、10–4、10–5、10–6、10–7 mg/L的2，4-eBL水溶液，作為水稻培養(yǎng)液。1 d后統(tǒng)計(jì)水稻幼苗初生根的根長及不對稱生長情況。

1.2.3 外源施加生長素不能導(dǎo)致水稻初生根不對稱生長 自來水配置終濃度分別為0、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1、10 mg/L的IAA水溶液和終濃度分別為0、10–6、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1 mg/L的2，4-D水溶液，作為水稻培養(yǎng)液。1 d后統(tǒng)計(jì)水稻幼苗初生根的根長及不對稱生長情況。

1.2.4 外源施加高濃度生長素抑制2，4-eBL導(dǎo)致的水稻初生根不對稱生長 自來水配置終濃度分別為0、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1、10 mg/L的IAA水溶液和終濃度分別為0、10–6、10–5、10–4、10–3、10–2、10–1、1 mg/L的2，4-D水溶液，在以上IAA或2，4-D濃度梯度水溶液中各加入2，4-eBL使其終濃度為10–2 mg/L，作為水稻培養(yǎng)液。2 d后統(tǒng)計(jì)水稻幼苗初生根的根長及不對稱生長情況。

1.2.5 GUS染色 取發(fā)生coiling的新鮮水稻根置于1.5 mL的離心管中，加入GUS染液（成分：100 mmol/L磷酸鈉緩沖液（pH 7.0）；10 mmol/L EDTA；0.1%（V/V）Triton X-100；0.5 mmol/L亞鐵氰化鉀；0.5 mmol/L鐵氰化鉀；20%（V/V）甲醇，1 mmol/L X-Glu），在37 ℃下溫浴12～36 h后用70%酒精脫色3次，顯微鏡觀察拍照。

1.3 培養(yǎng)條件

溫度（24±2）℃，光強(qiáng)1 000 lx，光周期為光照16 h/d，黑暗8 h/d。每個(gè)培養(yǎng)皿（? 150 mm）中均倒入30 mL培養(yǎng)液，調(diào)節(jié)pH=7.0，整齊接入30顆水稻種子（催芽2 d）/幼苗，設(shè)立5組重復(fù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

水稻幼苗初生根的不對稱生長比例=根發(fā)生不對稱生長的水稻幼苗數(shù)/水稻幼苗總數(shù)。采用u檢驗(yàn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組與對照組的顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 外源施加2，4-eBL導(dǎo)致水稻初生根不對稱生長

在實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，水稻幼苗根的不對稱生長有2種模式。① 波浪形彎曲（wave）：波峰、波谷交替出現(xiàn)，連續(xù)3次以上（波峰-波谷-波峰或波谷-波峰-波谷）（圖1-f）。② 卷曲（coiling）：根繞中心軸連續(xù)旋轉(zhuǎn)一圈以上（圖1-g）。wave與coiling可同時(shí)出現(xiàn)于同一根中，有wave-coiling、coiling-wave、wave-coiling-wave等各種形式，但以wave-coiling類型（圖1-h）為主。

在無2，4-eBL作用的情況下，水稻幼苗初生根自然向下生長，發(fā)生coiling、wave、wave+coiling的比例僅有0.5%、1%、0.6%（圖1-a、k）。將催芽2 d的水稻幼苗置于不同濃度2，4-eBL的培養(yǎng)液中，溫室條件下培養(yǎng)1 d，根的形態(tài)隨著2，4-eBL濃度的變化而變化。在濃度為10–7～10–3 mg/L時(shí)，根發(fā)生coiling、wave、wave+coiling的比例與對照無顯著差異，均低于7.0%。在2，4-eBL濃度為10–2 ～10–1 mg/L情況下根不對稱生長的比例迅速增加，均與對照有極顯著差異。其中濃度等于10–2 mg/L時(shí)，coiling、wave、wave+coiling的比例分別為46.8%、16.3%、17.8%。濃度為10–1 mg/L時(shí)，比例為35.3%、18.4%、31.7%（圖1-b、k）。對照組根長為1.41 cm，當(dāng)2，4-eBL濃度為10–7 mg/L時(shí)根增長為1.67 cm，與對照有顯著差異。當(dāng)濃度為10–6～10–1 mg/L時(shí)根長與對照無顯著差異（圖1-k）。

2.2 外源施加生長素不能導(dǎo)致水稻初生根不對稱生長

在無IAA作用的情況下，水稻幼苗發(fā)生coiling、wave、wave+coiling比例均小于6.0%。將催芽2 d的水稻幼苗置于不同濃度IAA的培養(yǎng)液中，溫室條件下培養(yǎng)1 d，根的形態(tài)在10–5～1 mg/L IAA濃度梯度下，coiling、wave、wave+coiling比例變化不大，均與對照無顯著差異。當(dāng)IAA濃度為10 mg/L時(shí)coiling、wave、wave+coiling的比例均為0，其中wave與對照出現(xiàn)極顯著差異（圖1-c、l）。對照組根長為1.30 cm，當(dāng)IAA濃度在10–5～10–1 mg/L時(shí)根長均與對照無顯著差異。當(dāng)IAA濃度為1～10 mg/L時(shí)根長受到抑制，長度分別為0.66、0.42 cm，均與對照有極顯著差異（圖1-i、l）。

在無2，4-D作用的情況下，coiling、wave、wave+coiling比例均小于3.5%。2，4-D濃度為10–6～10–1 mg/L時(shí)，coiling、wave、wave+coiling比例變化不大，均與對照無顯著差異，除10–1 mg/L時(shí)wave比例上升到13%。當(dāng)2，4-D 濃度為1 mg/L時(shí)coiling、wave、wave+coiling比例下降為0，其中wave與對照出現(xiàn)顯著差異（圖1-d、m）。對照組根長為1.52 cm，當(dāng)2，4-D濃度為10–6～10–4 mg/L時(shí)根長均與對照無顯著差異。當(dāng)2，4-D濃度大于10–4 mg/L時(shí)，隨著濃度增加根長逐漸縮短，10–3～10–2 mg/L時(shí)根長為1.35 cm、1.37 cm，均與對照有顯著性差異，10–1～1 mg/L時(shí)根長為1.04、0.63 cm，均與對照有極顯著差異（圖1-j、m）。

高濃度IAA和2，4-D均能抑制水稻初生根的生長，但在各個(gè)濃度處理中，根的不對稱生長率較低且沒有顯著的變化。

2.3 外源施加高濃度生長素抑制2，4-eBL導(dǎo)致的水稻初生根不對稱生長

在10–2 mg/L 2，4-eBL作用下，大部分根在2 d后被誘導(dǎo)發(fā)生了不對稱生長，coiling、wave、wave+coiling比例為86.2%、4.6%、4.1%（圖2-a、f）。當(dāng)添加不同濃度的IAA時(shí)，在0～1 mg/L IAA下根的不對稱生長沒有明顯變化，coiling、wave、wave+coiling的比例均與對照組無顯著差異。但在10 mg/L的IAA作用下根的不對稱生長現(xiàn)象基本消失，coiling、wave、wave+coiling比例為7.3%、6.0%、0，其中coiling、wave+coiling與對照組均有極顯著差異（圖2-b、f）。對照組根長為1.45 cm，當(dāng)IAA濃度為10–5～10–2 mg/L時(shí)根逐漸伸長，IAA濃度在10–5～10–4 mg/L時(shí)與對照有顯著差異，10–3～10–2 mg/L時(shí)與對照有極顯著差異。當(dāng)IAA濃度為10 mg/L時(shí)根長受到抑制，與對照有極顯著差異（圖2-f）。

在10–2 mg/L 2，4-eBL作用的情況下，大部分根在2 d后被誘導(dǎo)發(fā)生了不對稱生長，coiling、wave、wave+coiling比例為89.8%、1.1%、7.3%。當(dāng)添加不同濃度24-D時(shí)，在0～10–1 mg/L 24-D下coiling、wave、wave+coiling比例變化不大，與對照組無顯著差異。24-D濃度為1 mg/L時(shí)coiling、wave、wave+coiling比例均為0，其中coiling、wave+coiling與對照組均有極顯著差異（圖2-c、g），對照組根長為1.42 cm，在10–5～10–4 mg/L 24-D濃度下根長逐漸增長，均與對照有極顯著差異。在10–1～1 mg/L濃度下根長縮短，均與對照有極顯著差異（圖2-g）。

當(dāng)培養(yǎng)液中添加10 mg/L的IAA，由2，4-eBL造成的根不對稱生長現(xiàn)象完全消除，但隨著培養(yǎng)天數(shù)的延長，根的不對稱生長逐漸恢復(fù)。在0、1 d時(shí)，coiling、wave、wave+coiling比例均為0。2 d時(shí)，coiling、wave、wave+coiling比例為3.2%、8.4%、1.1%，此時(shí)wave已與0 d有極顯著差異。4 d時(shí)，coiling、wave、wave+coiling比例為57.9%、12.7%、23.1%，均與0 d有極顯著差異。同時(shí)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，根長也逐漸變長，對照組根長為0.13 cm，1、2、3、4 d后根長分別為0.43、0.73、2.28、3.28 cm，均與對照有極顯著差異。可見IAA對2，4-eBL造成的根不對稱生長的拮抗效應(yīng)并不具有持續(xù)性（圖2-d、h）。對培養(yǎng)液中的IAA濃度進(jìn)行測定，結(jié)果顯示IAA濃度隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而迅速降低，0 d時(shí)IAA濃度為10.5 mg/L，2 d時(shí)IAA濃度為2.15 mg/L，與0 d有極顯著差異，4 d時(shí)IAA僅剩0.4 mg/L（圖2-i）。而在添加2，4-D實(shí)驗(yàn)的0～4 d內(nèi)，coiling、wave、wave+coiling比例均為0，根長由0.3 cm緩慢生長到1 cm。表明2，4-D能夠持久地起到拮抗作用（圖2-e、j）。

2.4 DR5-GUS染色結(jié)果

DR5是生長素響應(yīng)的啟動(dòng)子，經(jīng)過GUS染色可以直接觀察到生長素在根中的分布。染色結(jié)果顯示，發(fā)生coiling的根中生長素的分布是不對稱的，根尖處內(nèi)圈染色較外圈深，表明內(nèi)圈生長素含量高（圖2-k）。

3 討論

本研究證明，高濃度2，4-eBL能誘導(dǎo)水稻初生根不對稱生長，形成wave和coiling，而調(diào)控植物生長的激素中唯獨(dú)生長素具有極性運(yùn)輸功能[19]。生長素的極性運(yùn)輸可以造成生長素的不對稱分布，從而造成根的不對稱生長[20]。由此看出生長素的極性運(yùn)輸與不對稱分布極有可能是造成根卷曲的直接內(nèi)在因素。通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)：

（1）高濃度2，4-eBL能誘導(dǎo)水稻根不對稱生長。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在高濃度2，4-eBL作用下，根的不對稱生長多為wave和coiling，與對照中根的隨機(jī)彎曲是不同的。wave和coiling是根有規(guī)律的不對稱生長，對照彎曲是根在觸碰瓶底后隨機(jī)發(fā)生的，兩者在形態(tài)上存在很大差異，易于區(qū)分。

（2）添加10–5～10 mg/L IAA或10–6～1 mg/L 2，4-D的情況下，根的不對稱生長率較低且沒有顯著的變化，說明外源施加生長素并不能誘導(dǎo)根不對稱生長。外源施加的生長素能通過根的吸收直接影響內(nèi)源生長素水平[21]。因此內(nèi)源生長素水平的高低不是造成根不對稱生長的原因。

（3）在IAA+10–2 mg/L 2，4-eBL或2，4-D+ 10–2 mg/L 2，4-eBL情況下，低濃度IAA或2，4-D不足以降低coiling及wave的比例，但當(dāng)施加10 mg/L的IAA或1 mg/L的2，4-D時(shí)明顯地抑制了coiling及wave的形成。導(dǎo)致2，4-D比IAA更顯著地破壞根不對稱生長的原因有3種，包括感知差異、運(yùn)輸差異和代謝差異。產(chǎn)生感知差異的原因是目前的2種生長素受體系統(tǒng)ABP1和TIR1對2，4-D的親和性大于IAA[21]。產(chǎn)生運(yùn)輸差異的原因是IAA具有輸出載體（PIN蛋白）輸出細(xì)胞，而2，4-D沒有輸出載體，只能通過被動(dòng)擴(kuò)散出細(xì)胞，于是在細(xì)胞中積累，導(dǎo)致其在細(xì)胞中濃度大于IAA[9， 22]。產(chǎn)生代謝差異是由于IAA是一種天然的植物激素，植物已經(jīng)發(fā)展出許多機(jī)制來調(diào)節(jié)其穩(wěn)態(tài)，而2，4-D是合成分子，因此不被植物代謝調(diào)節(jié)[21]。高濃度生長素對根不對稱生長的抑制作用是由于外援施加高濃度生長素具有使根中生長素趨于平均化的作用，趨向于高位，從而抑制了wave和coiling的形成。

（4）高濃度IAA對根不對稱生長的消除作用并不是長期的，2 d后消除作用減弱，coiling及wave會重新形成，這是培養(yǎng)液中的IAA被植株體內(nèi)的吲哆乙酸氧化酶氧化成沒有活性的吲哚醛的結(jié)果[23]。通過對培養(yǎng)液中IAA濃度的測定發(fā)現(xiàn)，吲哆乙酸氧化酶具有極強(qiáng)的氧化作用，3 d后就能將培養(yǎng)液中95%以上的IAA氧化完全。與IAA作用不同的是，2，4-D對根不對稱生長的抑制作用是長期的，這是由于植物體中沒有相應(yīng)的能夠氧化2，4-D的氧化酶[21]。

（5）通過DR5-GUS染色結(jié)果顯示根尖處內(nèi)圈染色較深，表明生長素在內(nèi)圈分布較高，可能是造成根不對稱生長的原因[24]。以上實(shí)驗(yàn)證明了BL能誘導(dǎo)水稻根不對稱生長，同時(shí)根內(nèi)生長素發(fā)生了不對稱分布。

有研究發(fā)現(xiàn)，BR和生長素信號顯著重疊。Nemhauser等研究表明，BR和生長素在控制擬南芥下胚軸伸長方面有很強(qiáng)的相互依賴性。為了擴(kuò)展這個(gè)分析，Nemhauser使用22K的Affymetrix芯片來識別BR與模擬處理幼苗之間差異表達(dá)的基因，發(fā)現(xiàn)由BR和生長素分別上調(diào)的342個(gè)和336個(gè)基因中，1/4在相似（早期）時(shí)期內(nèi)受到2種激素的調(diào)節(jié)。這些觀察結(jié)果表明，雖然BR和生長素獨(dú)立地調(diào)節(jié)大量基因，但重要的子集是由2種激素共同調(diào)控的[25-26]。同時(shí)也有證據(jù)表明BR和生長素是可以獨(dú)立運(yùn)作的，當(dāng)用BR處理擬南芥野生型（WT）或BR缺陷型突變體det2的幼苗時(shí)，內(nèi)源IAA水平不增加。目前許多研究發(fā)現(xiàn)了BR和生長素之間的相互作用，但是具體機(jī)理還知之甚少[27-28]。本文探究了2，4-eBL導(dǎo)致水稻初生根不對稱生長的現(xiàn)象及在此過程中高濃度生長素的抑制作用，為進(jìn)一步了解BR與生長素之間的關(guān)系提供理論依據(jù)。

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