胡明瑜 白文欽 潘曉雪 吳紅 雷開(kāi)榮

摘? ?要? ?方波脈沖對(duì)細(xì)胞電擊轉(zhuǎn)化的效果優(yōu)于指數(shù)波脈沖。目前，酵母電轉(zhuǎn)化常使用的是指數(shù)波脈沖，方波脈沖轉(zhuǎn)化酵母的研究較少。為了優(yōu)化方波脈沖轉(zhuǎn)化釀酒酵母的條件，在1M山梨醇的電擊緩沖體系中，以釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株EGY48為試驗(yàn)對(duì)象，使用方波脈沖轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，通過(guò)統(tǒng)計(jì)酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量，摸索和優(yōu)化脈沖電壓、脈沖次數(shù)和脈沖寬度的參數(shù)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，脈沖電壓為500 V，脈沖寬度為15 ms，脈沖次數(shù)為1～3次時(shí)，方波脈沖轉(zhuǎn)化酵母的效率較高。

關(guān)鍵詞? ?方波脈沖;電轉(zhuǎn)化;釀酒酵母;脈沖電壓;脈沖寬度;脈沖次數(shù)

中圖分類號(hào)：Q78? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A? ? DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.017

方波是一種特殊的脈沖波，在峰值和低值之間瞬時(shí)變換。在對(duì)細(xì)胞進(jìn)行方波電擊時(shí)，脈沖電壓瞬間達(dá)到峰值，維持一定的脈沖寬度后，瞬間降為低值，完成一次方波脈沖。已有大量研究表明，方波脈沖對(duì)細(xì)胞電擊轉(zhuǎn)化的效果好于指數(shù)衰減脈沖波。Takahashi等[1]對(duì)人白血病細(xì)胞K562進(jìn)行基因電擊轉(zhuǎn)化，在β-半乳糖苷酶基因瞬時(shí)表達(dá)試驗(yàn)中，指數(shù)衰減波的轉(zhuǎn)化率僅為1%，方波脈沖的轉(zhuǎn)化率約為5%，而且細(xì)胞存活率更高;在新霉素抗性基因的細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)中，方波脈沖轉(zhuǎn)化率接近1%，指數(shù)衰減波轉(zhuǎn)化率不到0.01%。Liu等[2]用熒光標(biāo)記的寡聚核苷酸，比較方波脈沖和指數(shù)波脈沖轉(zhuǎn)化不同造血細(xì)胞的效果，方波脈沖轉(zhuǎn)染效率更高，而且轉(zhuǎn)入的寡聚核苷酸的活性更強(qiáng)。Vierra等[3]對(duì)玻璃海鞘（Ciona intestinalis）的受精卵進(jìn)行電擊轉(zhuǎn)化，兩種脈沖方式轉(zhuǎn)化的LacZ基因在胚中瞬時(shí)表達(dá)效率接近，而方波脈沖轉(zhuǎn)化后，正常發(fā)育胚的比例更高。此外，利用方波脈沖對(duì)血吸蟲(chóng)、豬胎成纖維細(xì)胞等成功轉(zhuǎn)入RNA、DNA等生物大分子[4-5]。這些研究表明方波脈沖電轉(zhuǎn)化效率高、適應(yīng)性廣，具有較廣泛的用途。

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是真核單細(xì)胞微生物，基于釀酒酵母開(kāi)發(fā)的分析技術(shù)已廣泛應(yīng)用于不同生物的生長(zhǎng)發(fā)育、病原與寄主的致病/抗病機(jī)理、生物與環(huán)境/激素信號(hào)應(yīng)答等多方面的研究。釀酒酵母易于培養(yǎng)，可作為生物反應(yīng)器大規(guī)模生產(chǎn)難以化學(xué)合成的生物活性大分子。例如，Callari等[6]在釀酒酵母中分別表達(dá)細(xì)菌中的ssf基因簇和不同植物來(lái)源的酯酰輔酶A連接酶基因，用于合成具有抗癌、抗炎、抗痙攣等活性的當(dāng)歸酯化物前體當(dāng)歸酰輔酶A。優(yōu)化的生物反應(yīng)器以丙酸為底物，產(chǎn)生的當(dāng)歸酰輔酶A滴度達(dá)到6.4 mg·L-1;以當(dāng)歸酸為底物產(chǎn)生的當(dāng)歸酰輔酶A滴度達(dá)到40 mg·L-1。釀酒酵母的轉(zhuǎn)化方法有化學(xué)法和電擊法，其中電擊法常用的是指數(shù)衰減脈沖波，而利用方波脈沖對(duì)酵母轉(zhuǎn)化質(zhì)粒等大分子的研究較少。冀照君等[7]在0.6 mol·L-1的蔗糖溶液中優(yōu)化了方波脈沖電穿孔酵母細(xì)胞的條件，表明方波脈沖可以有效增強(qiáng)酵母細(xì)胞通透性，但沒(méi)有開(kāi)展酵母轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。本試驗(yàn)在1M山梨醇的電擊緩沖體系中，以釀酒酵母EGY48營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株為研究對(duì)象，優(yōu)化方波脈沖電擊參數(shù)，建立了穩(wěn)定的方波脈沖電轉(zhuǎn)化方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 酵母菌株和質(zhì)粒

從OriGene公司購(gòu)買DupLEX-ATM酵母雙雜交試劑盒。使用的酵母為營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株EGY48（MATα，trp1，his3，ura3，leu2：：6，LexAop-LEU2），該菌株已導(dǎo)入pSH18-34報(bào)告質(zhì)粒和pEG202-GID1質(zhì)粒，這兩個(gè)質(zhì)粒分別包含URA3和HIS3基因。試驗(yàn)中，酵母轉(zhuǎn)化用pJG4-5-D8N質(zhì)粒包含TRP1基因。

1.1.2 主要生化試劑

山梨醇、尿嘧啶、組氨酸、色氨酸、YNB均購(gòu)于上海生工生物有限公司。

1.1.3 主要儀器和耗材

ECM830型方形波電轉(zhuǎn)儀和1 mm電轉(zhuǎn)化杯為美國(guó)BTX公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酵母感受態(tài)細(xì)胞制備

每組處理使用同一批酵母感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，參照OriGene公司試劑盒操作指南和BTX公司ECM 399型電轉(zhuǎn)化儀實(shí)驗(yàn)指南制備感受態(tài)細(xì)胞。用接種環(huán)取EGY48菌株在YNB（-His-Ura）平板上劃線培養(yǎng);30 ℃下培養(yǎng)3 d后，挑取單菌落，接種于10 mL YNB（-His-Ura）液體培養(yǎng)基，30℃、200 rpm培養(yǎng)16～

20 h;取100 μL培養(yǎng)液稀釋10倍，測(cè)量OD600吸光值為0.5～0.8;吸取1.25～2.00 mL菌液到100 mL YNB（-His-Ura）液體培養(yǎng)基，30℃、200 rpm培養(yǎng)5～6 h，OD600吸光值為0.6～0.8;5 000 rpm離心5 min，去掉上清，收集菌體，加入30 mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水，重懸菌體;用無(wú)菌水重復(fù)清洗兩次;離心收集菌體，倒掉上清，加入20 mL預(yù)冷的1M山梨醇重懸;離心后，去掉上清，加入1.2 mL預(yù)冷的1M山梨醇重懸;按每管70μL分裝，備用。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化

用試劑盒提取pJG4-5-D8N質(zhì)粒，測(cè)定濃度為

350 ng/μL;取1 μL加入酵母感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻;冰上靜置5 min，輕輕吸出加入預(yù)冷的電擊轉(zhuǎn)化杯;按照文中表述的不同參數(shù)電擊轉(zhuǎn)化;迅速向電擊杯加入1 mL預(yù)冷的1M山梨醇;吸出菌液，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管，離心收集菌體;用殘留的少量上清液重懸菌體后，菌液轉(zhuǎn)移到Y(jié)NB（-His-Ura-Trp）平板上推平板，30 ℃倒置培養(yǎng)3～5 d。

1.2.3 酵母轉(zhuǎn)化率

每個(gè)電擊轉(zhuǎn)化事件中，pJG4-5-D8N質(zhì)粒用量約為350 ng。酵母轉(zhuǎn)化率換算為每微克質(zhì)粒轉(zhuǎn)化子數(shù)，應(yīng)乘以2.86系數(shù)。

1.2.4 酵母轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

制備少量酵母菌液作為模板，用引物對(duì)D8N-1（5′-AAGCGCGAGTACCAAGACGCC-3′）和D8N-2（5′-CACGGCGGGCGGGAGATCG-3′）進(jìn)行擴(kuò)增驗(yàn)證。擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性5 min，1個(gè)循環(huán);94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠電泳約20 min，凝膠成像系統(tǒng)觀察照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 方波脈沖電壓優(yōu)化

ECM830型方形波電轉(zhuǎn)化儀有低壓和高壓兩種電擊模式，低壓模式電壓范圍是5～500 V，脈沖寬度為10 μs～10 s;高壓模式電壓范圍是505～3 000 V，脈沖寬度10～500 μs。由于低壓和高壓模式的脈沖寬度范圍限制，分別選擇低壓模式脈沖電壓500 V和高壓模式脈沖電壓750 V，進(jìn)行酵母電轉(zhuǎn)化試驗(yàn)。電擊轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，設(shè)置脈沖電壓500 V，脈沖寬度4 ms，單次脈沖僅能獲得1～2個(gè)轉(zhuǎn)化子;脈沖2次，能獲得約10個(gè)轉(zhuǎn)化子。而在高壓模式下，脈沖電壓750 V，脈沖寬度400 μs，分別脈沖5、8和10次，僅能獲得少量轉(zhuǎn)化子（見(jiàn)表1）。這說(shuō)明采用低壓模式，設(shè)置方波脈沖電壓500 V較適合酵母轉(zhuǎn)化。

2.2 方波脈沖次數(shù)優(yōu)化

在低壓模式下，設(shè)置脈沖電壓500 V，脈沖寬度4 ms，脈沖次數(shù)分別設(shè)為2、3、4、5、6次，對(duì)酵母進(jìn)行電轉(zhuǎn)化。結(jié)果表明，脈沖2次獲得酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量較少;脈沖5次、6次，酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量在10～20;脈沖4次酵母轉(zhuǎn)化子達(dá)到30個(gè);脈沖3次獲得的酵母轉(zhuǎn)化子最多，達(dá)到77個(gè)（見(jiàn)表2）。這說(shuō)明在脈沖電壓500 V、脈沖寬度4 ms的條件下，脈沖3次的酵母轉(zhuǎn)化效率較高。

2.3 脈沖寬度優(yōu)化

在低壓模式下，設(shè)置脈沖電壓500 V，脈沖寬度分別為5 ms、10 ms、15 ms、20 ms、25 ms。通過(guò)單次脈沖轉(zhuǎn)化酵母，比較不同脈沖寬度的電轉(zhuǎn)化效果。結(jié)果表明（見(jiàn)表3），脈沖寬度為5 ms、10 ms時(shí)，獲得酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量分布在25～46;脈沖寬度為15 ms時(shí)，獲得酵母轉(zhuǎn)化子急劇增加到167個(gè);脈沖寬度增加為20 ms、25 ms時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量反而降低，而且分別有約20.1%和31.7%的菌落在培養(yǎng)3 d后才出現(xiàn)，生長(zhǎng)速度減緩。這說(shuō)明用脈沖電壓500 V進(jìn)行單次電擊，脈沖寬度在15 ms時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化效率較高。

2.4 不同脈沖寬度3次脈沖的轉(zhuǎn)化效果比較

在低壓模式下，設(shè)置脈沖電壓500 V，脈沖次數(shù)為3次，脈沖寬度分別為5 ms、10 ms、15 ms、20 ms、25 ms。酵母轉(zhuǎn)化結(jié)果表明，脈沖寬度為10 ms、15 ms、20 ms時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量均分布在50～70范圍內(nèi);脈沖寬度為25 ms時(shí)，獲得的酵母轉(zhuǎn)化子分布在60～90范圍內(nèi)（表4）。然而，觀察菌落生長(zhǎng)情況，發(fā)現(xiàn)10 ms和15 ms脈沖處理酵母轉(zhuǎn)化子生長(zhǎng)速度較快，菌落大小均勻一致;而20 ms和25 ms處理中，分別約有49.5%和72.3%菌落在培養(yǎng)3 d后才出現(xiàn)，生長(zhǎng)速度減緩。

2.5 酵母轉(zhuǎn)化子鑒定

每個(gè)平板隨機(jī)挑取酵母單菌落，在10 μL的ddH2O中吹吸混勻，取1 μL混懸菌液為模板，擴(kuò)增D8基因片段。電泳結(jié)果顯示，在所有檢測(cè)的酵母單菌落中均擴(kuò)增出約500 bp的目標(biāo)片段，而未轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的酵母陰性對(duì)照中不能擴(kuò)增出目標(biāo)帶（見(jiàn)圖1）。這表明在YNB（-His-Ura-Trp）平板中生長(zhǎng)的酵母單菌落為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

3 小結(jié)

ECM830型方形波電轉(zhuǎn)化儀在不同脈沖電壓模式下，脈沖寬度范圍不同，在高壓模式下，脈沖寬度上限僅為500 μs。而采用指數(shù)衰減波電轉(zhuǎn)化酵母時(shí)，常用脈沖寬度為4～4.5 ms。推測(cè)在高壓模式下，脈沖寬度可能難以滿足酵母電轉(zhuǎn)化條件。試驗(yàn)中，設(shè)置脈沖電壓750 V，脈沖寬度400 μs，脈沖10次，僅獲得極少的酵母轉(zhuǎn)化子，表明在高壓模式下電轉(zhuǎn)化酵母難度較大。因此，選擇在脈沖電壓500 V的低壓模式下，優(yōu)化方波脈沖電轉(zhuǎn)化條件。

脈沖次數(shù)是電轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要參數(shù)，脈沖次數(shù)太少對(duì)細(xì)胞的穿孔效果不好，影響質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞;脈沖次數(shù)過(guò)多，對(duì)細(xì)胞造成的損傷大，細(xì)胞難以存活，導(dǎo)致轉(zhuǎn)化效率降低。試驗(yàn)中，脈沖電壓500 V，脈沖寬度4 ms，脈沖3次時(shí)轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到77個(gè)，進(jìn)一步增加脈沖次數(shù)，轉(zhuǎn)化子數(shù)量反而逐漸減少。表明脈沖寬度在4 ms 及更長(zhǎng)時(shí)，脈沖次數(shù)應(yīng)該在3次以內(nèi)。

在酵母電轉(zhuǎn)化過(guò)程中，脈沖電壓為500 V時(shí)，獲得大量的酵母轉(zhuǎn)化子，表明在細(xì)胞兩側(cè)施加的電壓能夠產(chǎn)生微孔，并且微孔大小可以使質(zhì)粒進(jìn)入細(xì)胞。脈沖寬度也是電轉(zhuǎn)化的重要參數(shù)，對(duì)細(xì)胞膜微孔的形成、形態(tài)維持、孔徑大小有重要影響。在脈沖電壓為500 V時(shí)，分析了不同脈沖寬度對(duì)酵母轉(zhuǎn)化的影響，試驗(yàn)顯示，脈沖寬度為15 ms時(shí)，獲得的酵母轉(zhuǎn)化子最多，達(dá)到167個(gè)，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他脈沖寬度處理獲得的酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量。這說(shuō)明脈沖電壓為500 V，脈沖寬度為15 ms，單次脈沖在細(xì)胞膜表面產(chǎn)生的微孔數(shù)量和大小最有利于質(zhì)粒轉(zhuǎn)移。

進(jìn)一步探討不同脈沖寬度多次脈沖電轉(zhuǎn)化酵母的效果，結(jié)果顯示脈沖寬度為10 ms、15 ms、20 ms和25 ms時(shí)，酵母轉(zhuǎn)化子數(shù)量分布在50～90，沒(méi)有明顯差異。然而，脈沖寬度為20 ms和25 ms時(shí)，可能對(duì)細(xì)胞傷害較大，分別約有49.5%和72.3%的菌落生長(zhǎng)速度減緩。綜合試驗(yàn)結(jié)果，方波脈沖電轉(zhuǎn)化酵母，脈沖電壓為500 V，脈沖寬度為15 ms，脈沖次數(shù)為1～3次時(shí)，質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率較高。

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