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        中藥渣抗藥性轉(zhuǎn)化菌的篩選及酶活性測定

        2018-05-14 11:32:26張義剛聶銘胡留杰孫志洪陳霞謝永紅
        南方農(nóng)業(yè)·上旬 2018年12期

        張義剛 聶銘 胡留杰 孫志洪 陳霞 謝永紅

        摘? ?要? ?以藥渣和纖維素為唯一碳源,通過平板初篩及多種酶活綜合測定復(fù)篩,從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復(fù)合菌系Y-5,從Y-5供試樣品中分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株,其中細菌54株,真菌18株,通過菌群耦合培養(yǎng),獲得了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的YEM耦合菌群,對中藥渣的降解能力提高64.6%。

        關(guān)鍵詞? ?中藥渣;抗藥性轉(zhuǎn)化菌;篩選

        中圖分類號:S182? ? 文獻標(biāo)志碼:A? ? DOI:10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.34.008

        西南地區(qū)是中藥材生產(chǎn)和加工的核心區(qū),如重慶太極、云南白藥和貴州百靈等幾十家全國大型中成藥制藥企業(yè)均在此設(shè)立工廠。據(jù)估計,我國中藥企業(yè)每年要消耗植物類藥材數(shù)百萬噸,隨之產(chǎn)生的植物類藥渣多達幾千萬噸(含水分)[1]。這些藥渣造成大量環(huán)境污染,如何有效處理是一個令人深感棘手的大問題。中藥渣中含有纖維素、半纖維素、木質(zhì)素和生物堿等主要組分,其中包括難以降解的生物堿、纖維素和木質(zhì)素。傳統(tǒng)的堆肥處理存在周期長、發(fā)酵不充分等問題,其主要原因在于藥渣具有較強的抑菌性,一般的堆肥菌劑微生物在藥渣中成活率低,生長速度慢,形成不了穩(wěn)定的高活性菌群[2-3]。目前,關(guān)于纖維素降解菌和纖維素酶的研究報道較多[4-8],主要集中于對秸稈、糞便的降解,而關(guān)于對中藥渣降解的報道則較少[9-12]。本試驗以中藥渣為降解源,擬從腐熟藥渣中初步篩選出高效無毒的抗藥性藥渣降解菌,再進行復(fù)篩,同時對其酶活性進行測定,以便開發(fā)出用于藥渣好氧堆肥處理的高效微生物菌劑。

        1 材料與方法

        1.1 試驗材料

        1.1.1 含菌樣品

        2014年5月,在太極集團涪陵制藥廠藥渣堆放區(qū)和重慶土原生物科技有限公司藥渣堆肥區(qū),采集腐熟藥渣樣品4份及長期堆放藥渣的表層土壤4份。采集樣品后立即帶回實驗室接種,進行富集培養(yǎng)。

        1.1.2 培養(yǎng)基

        本試驗中使用富集培養(yǎng)基、CMC-Na固體培養(yǎng)基、纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基及液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基等,其具體配置方法參照郭建軍等[13]。

        1.2 方法

        1.2.1 菌種富集

        稱取菌種來源樣品5 g,加入以藥渣為唯一碳源的100 mL富集培養(yǎng)基中,28 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)7 d,吸取5 mL培養(yǎng)液轉(zhuǎn)入新的富集培養(yǎng)基,富集3代。

        1.2.2 菌種初篩和復(fù)篩

        取富集3代的培養(yǎng)液適當(dāng)稀釋,在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上分離純化菌種,觀察平皿上是否出現(xiàn)水解環(huán)及水解環(huán)的大小;初步比較不同菌株的纖維素酶酶活,并確定用于酶活測定的菌株。將分離得到的優(yōu)勢菌株分別接入液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基,在37 ℃振蕩培養(yǎng)4 d,將發(fā)酵液用2層紗布過濾,濾液于4 ℃、5 000 r·min-1離心20 min,上清液即為粗酶液。

        1.2.3 菌群耦合培養(yǎng)

        用產(chǎn)酶液體培養(yǎng)基將復(fù)選所得的菌株與TEM菌株等比例混合培養(yǎng),形成TSM、YEM菌群,耦合菌群在2%菌種接種量、32 ℃培養(yǎng)溫度、每2 h通氣10 min、通氣量300 ml·min-1條件下培養(yǎng)5 d,測定各組合菌群的酶活性。

        1.2.4 酶活性測定

        采用DNS 還原糖法測定各纖維素酶酶活性,包括全酶活性(FPA)、內(nèi)切酶酶活性(Cx)和外切酶酶活性(CI)[14]。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌種初篩結(jié)果

        將腐熟藥渣及堆放土壤樣品,在以藥渣為唯一碳源的培養(yǎng)基中進行3代富集。從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復(fù)合菌系Y-5,在50 ℃靜止培養(yǎng)條件下,在第7天可使濾紙的分解率達到83%,其中對纖維素、半纖維素的分解率分別為75%、78%。復(fù)合菌系Y-5經(jīng)過3次富集培養(yǎng),菌系種類組成和分解能力都具有較好的穩(wěn)定性,生長速度快。利用CMC分離培養(yǎng)基50 ℃培養(yǎng)分離復(fù)合菌系Y-5中的菌株,分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株,其中細菌54株、真菌18株,主要由芽孢桿菌屬、梭菌屬和瘤胃桿菌屬組成。分離得到的纖維素降解菌能快速地在纖維素-剛果紅固體培養(yǎng)基上產(chǎn)生清亮的水解環(huán),其中L1和L2菌株在平板上較快地產(chǎn)生了較大的水解環(huán)。

        2.2 菌種復(fù)篩結(jié)果

        纖維素的降解是多酶體系作用的結(jié)果,選擇測定降解圈、Cx、CI、FPA 3 種酶活性大小作為菌種的復(fù)篩依據(jù)。將菌種分別接入以藥渣和CMC-Na為碳源的固體培養(yǎng)基和液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基。通過CMC-Na固體培養(yǎng)基培養(yǎng),有8個菌株快速形成菌落和CMC降解圈。菌斑測定結(jié)果(見表1)表明,L2菌落直徑最大,對CMC-Na的降解率最高,平均降解率達到4.03%;其余菌株的平均降解率均大于2%,表明8個復(fù)選菌株都具有較強的纖維素分解能力。

        通過藥渣和CMC-Na 為碳源的液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后的酶活測定結(jié)果見表2。對于FPA活性,以藥渣為碳源的真菌L2菌株最高,達到8.13 U·mL-1,其次較高的菌株為細菌2#、細菌5#、真菌L1和細菌3#,F(xiàn)PA活性均大于6 U·mL-1。以CMC-Na 為碳源的真菌L1 FPA活性最高,達到8.52 U·mL-1,其次真菌L2和細菌2#相對較高。對于Cx活性,真菌L2和細菌2#在藥渣和CMC-Na中碳源均較高,但真菌L1對藥渣的外切分解能力較弱,且它們的Cx與其他菌相比差異較大。對于CI活性,在藥渣和CMC-Na碳源中,真菌L2、細菌1#、細菌2#的活性較高,但真菌L1在外切酶和總酶活性上較差。這些表明真菌L2和細菌2#菌株降解藥渣和纖維素的能力比其他菌株要強,酶活測定結(jié)果與水解環(huán)測定結(jié)果基本吻合。

        2.3 菌群耦合結(jié)果

        YEM菌種培養(yǎng)周期為5 d,培養(yǎng)72 h各組合菌群的菌液OD600均達到1.25以上,活菌數(shù)量大于15億/mL,YEM耦合菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

        通過酶活性測定結(jié)果(見表3)表明,YEM組合菌群無論是在藥渣或CMC-Na基質(zhì)中的纖維素酶全酶活性FPA顯著高于單一菌株的酶活性。常規(guī)堆肥TEM菌群在CMC-Na基質(zhì)中表現(xiàn)出較高的FPA活性,但在以中藥渣為單一基質(zhì)中的FPA活性較低。YEM組合菌群因添加了對藥渣降解能力較強的菌株,其纖維素全酶活性在藥渣和CMC-Na基質(zhì)中都表現(xiàn)出明顯增加趨勢,其中在藥渣基質(zhì)中FPA活性提高64.6%,在CMC-Na基質(zhì)中也提高25.4%。篩選的抗藥性藥渣降解菌株真菌L2、細菌2#具有良好的共生增效特性,與EM耦合菌群結(jié)構(gòu)穩(wěn)定,增效明顯,YEM菌群在中藥渣處理中具有廣泛的應(yīng)用前景。

        3 結(jié)論

        針對中藥渣的抑菌特性,從藥渣高溫腐熟階段篩選出的復(fù)合菌系Y-5,在50 ℃靜止培養(yǎng)條件下,在第7天可使濾紙的分解率達到83%,其中對纖維素、半纖維素的分解率分別為75%、78%。利用CMC-Na分離培養(yǎng)基50 ℃培養(yǎng)分離,從Y-5供試樣品中分離到能以CMC-Na作為唯一碳源生長的高溫微生物菌株72株,其中細菌54株、真菌18株;利用剛果紅纖維素篩選培養(yǎng)基進行進一步篩選,得到具有較強纖維素降解能力的菌株8株,其中細菌6株、真菌2株,復(fù)選菌株對纖維素的降解率均大于3.0%。通過藥渣基質(zhì)和CMC-Na基質(zhì)產(chǎn)酶活性測定,篩選出真菌L2和細菌2#菌株對藥渣和纖維素降解能力都強的抗藥性菌株。通過菌群耦合培養(yǎng),獲得了結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的YEM耦合菌群,菌種培養(yǎng)5 d活菌數(shù)量大于15億/ml,YEM菌劑的纖維素酶活性較Em菌劑提高25.4%~64.6%,尤其是對中藥渣的降解能力提高64.6%,在中藥渣處理中具有廣泛的應(yīng)用前景。

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