金清　張蕾　蔣秋悅　蘇翠珠　肖明

摘 要： 通過GenBank數(shù)據(jù)庫尋找能產(chǎn)生表面活性素、伊枯草菌素或豐原素并在基因組中其合成基因已得到注釋的芽胞桿菌，經(jīng)過BLAST比對序列初步確定這三類脂肽類抗菌肽的合成基因簇的位置，再運(yùn)用antiSMASH進(jìn)行其合成基因簇的最終定位.對表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的結(jié)構(gòu)及相關(guān)的合成酶結(jié)構(gòu)域進(jìn)行了預(yù)測與分析.

關(guān)鍵詞： 生物信息學(xué)； Bacillus velezensis S3-1； 表面活性素； 伊枯草菌素； 豐原素

中圖分類號： Q 93 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號： 1000-5137（2018）04-0451-07

Abstract： In this study，the GenBank database was used to search for Bacillus which could produce surfactin，iturin or fengycin and its synthetic genes were annotated in the genome.The location of the synthetic gene clusters of these three lipopeptide antibiotics were determined by BLAST alignment.Then antiSMASH was used to determine the final location of the synthetic gene clusters.Further，we predicted and analyzed the structure and related synthetase domains of the surfactin，iturin and fengycin.

Key words： bioinformatics； Bacillus velezensis S3-1； surfactin； iturin； fengycin

0 引 言

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的使用對病蟲害的防治起到重要的作用，但長期不合理的施用會引起土壤污染、農(nóng)作物產(chǎn)量降低等問題[1-3].Bacillus velezensis S3-1是一株在植物促生和防病方面效果較為顯著的芽胞桿菌屬菌株[4].B.velezensis S3-1具有廣譜抑菌效果，能夠產(chǎn)生6種表面活性素（surfactin）、3種伊枯草菌素（iturin）和4種豐原素（fengycin），這三類脂肽類化合物能抑制農(nóng)作物病害.而且能夠同時產(chǎn)生這三類重要脂肽類化合物的芽胞桿菌并不常見，這使得B.velezensis S3-1具有廣闊的開發(fā)前景[5].

目前，B.velezensis S3-1 全基因組序列已公布.其中部分芽胞桿菌中表面活性素、伊枯草菌素或豐原素合成基因簇已得到注釋，但B.velezensis S3-1的合成基因簇還不明確.本研究以 B.velezensis S3-1基因組數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過基因組挖掘技術(shù)對其基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)合NCBI、antiSMASH等生物信息學(xué)工具，進(jìn)行B.velezensis S3-1的表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的合成基因簇的定位，同時將基因、基因簇、化合物結(jié)構(gòu)特征、生物合成途徑等功能相互聯(lián)系起來，從而為B.velezensis S3-1 應(yīng)用于土傳病害實(shí)驗(yàn)、土壤改良劑的研制，及為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)，同時也為進(jìn)一步挖掘和利用B.velezensis S3-1的生物學(xué)信息提供借鑒.

1 材料與方法

1.1 菌株和基因組

本研究使用的菌株為B.velezensis S3-1，保存于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號為CCTCC AB 2014337.該菌株全基因組序列已經(jīng)測定完畢，登錄號為CP016371.1.

1.2 使用的數(shù)據(jù)庫及分析軟件

使用的數(shù)據(jù)庫：GenBank.

使用的分析軟件：BLAST，Glimmer 3，HMMER 3，antiSMASH.

1.3 用于比對的菌株和基因組

經(jīng)BLAST分析后用于之后進(jìn)行比對的31株芽胞桿菌，其全基因組序列已經(jīng)測定完畢并得到注釋，菌株名稱和序列登錄號見表1.

2 結(jié)果與討論

2.1 表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的合成基因簇的探尋

通過BLAST分析軟件，在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到了31株已明確表面活性素、伊枯草菌素或豐原素合成基因位置的芽胞桿菌，其全基因組序列已經(jīng)測定完畢并得到注釋，但各菌株基因組中具有的抗菌肽種類不同（表2）.

2.2 表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的合成基因簇的定位

通過將上述芽胞桿菌中的表面活性素、伊枯草菌素或豐原素合成基因簇序列與B.velezensis S3-1全基因組序列進(jìn)行比對分析，確定其合成基因簇的初步位置.通過antiSMASH分析，確定了B.velezensis S3-1的表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的合成基因簇的精確定位（表3，圖1）.

srfAA、srfAB、srfAC、srfAD和sfp為編碼表面活性素的合成基因，srfAA、srfAB、srfAC共同構(gòu)成srfA操縱子，sfp基因（長約4.5 kb）則是參與表面活性素合成的第二調(diào)控元件[6-16].ituC、ituB、ituA 和ituD為編碼伊枯草菌素的合成基因，共同構(gòu)成itu操縱子（長約38 kb）[17-18].fenE、fenD、fenC、fenB和 fenA為編碼豐原素合成酶的基因，共同構(gòu)成fen操縱子（長約37 kb）[19-22].

2.3 表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的合成酶結(jié)構(gòu)域的預(yù)測與分析

表面活性素、伊枯草菌素和豐原素是通過非核糖體肽鏈合成酶（non-ribosomal peptide synthetase，NRPS）合成的次級代謝產(chǎn)物，由胞內(nèi)游離氨基酸經(jīng)活化后結(jié)合到合成酶系特定的結(jié)構(gòu)域，從而實(shí)現(xiàn)肽鏈的延長和環(huán)化[23-24].

圖2為B.velezensis S3-1中表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的合成酶結(jié)構(gòu)域.其中 A代表腺苷?；Y(jié)構(gòu)域（adenylation domain），負(fù)責(zé)識別和腺苷酰化特定的氨基酸；PCP代表肽酰載體蛋白（peptidyl carrier protein），負(fù)責(zé)運(yùn)載氨基酸；C代表縮合結(jié)構(gòu)域，負(fù)責(zé)肽鍵形成；TE代表硫酯酶結(jié)構(gòu)域（thioesterase domain），負(fù)責(zé)釋放多肽和肽的環(huán)化；E代表差向異構(gòu)酶結(jié)構(gòu)域（epimerization domain），負(fù)責(zé)將被激活的L-氨基酸轉(zhuǎn)化為D-氨基酸.全酶由多個模塊按特定的空間順序排列而成，模塊的數(shù)量、種類及排列次序決定了氨基酸種類、順序和最終產(chǎn)物肽鏈的長短[25-27].

圖3為表面活性素的結(jié)構(gòu)，圖4為伊枯草菌素和豐原素的結(jié)構(gòu).由于伊枯草菌素和豐原素基因簇距離較近（圖1），故二者結(jié)構(gòu)連接在一起，但二者之間的基因簇從何處進(jìn)行劃分則有待進(jìn)一步研究.表面活性素中氨基酸順序?yàn)椋篏lu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu；伊枯草菌素中氨基酸順序?yàn)椋篏lu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Glu-Tyr-Ile；豐原素中氨基酸順序?yàn)椋篈sn-Tyr-Asn-Pro-Asn-Ser.

3 結(jié) 論

基于GenBank數(shù)據(jù)庫，利用BLAST等軟件分析了B-velezensis S3-1的表面活性素、伊枯草菌素和豐原素的結(jié)構(gòu).進(jìn)一步，可以通過改變培養(yǎng)基、培養(yǎng)方式和添加誘導(dǎo)物等方式激活這三類脂肽相關(guān)基因的表達(dá)，從而分離獲得相應(yīng)的脂肽.另一方面，可以利用基因操作手段激活B-velezensis S3-1這三類脂肽相關(guān)基因的表達(dá)，從而獲得化合物.最終為B-velezensis S3-1代謝工程優(yōu)化及結(jié)構(gòu)修飾改造奠定基礎(chǔ)，使其能更好地應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域.

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（責(zé)任編輯：顧浩然）