閻潔 沈楚儀 李彤

摘要 [目的]探討大西洋鱈魚皮多肽的體外抗氧化活性。[方法]選擇胰蛋白酶酶解鱈魚皮，分別以氨基氮滴定法和DPPH自由基清除率作為篩選指標(biāo)，通過正交試驗，篩選出酶解的最優(yōu)條件；將超濾液分成5段，分別進(jìn)行DPPH自由基清除率、ABTS自由基力及亞鐵離子螯合能力的體外抗氧化活性。[結(jié)果]胰蛋白酶酶解大西洋鱈魚皮的最優(yōu)條件為料液比1∶1，加酶量2 500 U/g、酶解時間4 h、溫度45 ℃、pH 9.0。當(dāng)分子量小于5 kD時，DPPH自由基清除能力、ABTS自由基清除能力和Fe.2+離子螯合能力最強(qiáng)。[結(jié)論]經(jīng)胰蛋白酶酶解，獲得的大西洋鱈魚皮多肽存在較好的抗氧化活性。

關(guān)鍵詞 鱈魚皮；多肽；胰蛋白酶；抗氧化

中圖分類號 TS254 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0144-04

Abstract [Objective] The research aimed to discuss the antioxidant activity of Atlantic codfish skin polypeptides in vitro.[Method]The enzymatic codfish skin was selected by trypsin， amino nitrogen titration method and DPPH free radical scavenging rate were used as screening indicators. The optimum conditions for enzymolysis were screened by orthogonal test.The ultrafiltrate was divided into 5 segments and the antioxidant activities in vitro of DPPH free radical scavenging rate， ABTS free radical force and ferrous ion chelating ability were performed.[Result]The optimal conditions for trypsin enzymatic hydrolysis of Atlantic codfish skin were： solid-liquid ratio 1∶1， enzyme dosage 2 500 U/g， hydrolysis time 4 h， temperature 45 ℃， and pH 9.When the molecular weight was less than 5 kD， DPPH radical scavenging ability， ABTS radical scavenging ability， and Fe.2+ ion chelating ability were the strongest.[Conclusion]After trypsin digestion， the obtained Atlantic codfish skin polypeptides has better antioxidant activity.

Key words Codfish skin；Polypeptides；Trypsin；Antioxidant

鱈魚是全球年捕撈量最大的魚類之一，有重要的食用和經(jīng)濟(jì)價值，主要分為大西洋鱈魚、格陵蘭鱈魚和太平洋鱈魚。在我國，鱈魚主要分布于黃海和東海北部，鱈魚皮中富含的蛋白質(zhì)最高可達(dá)總量的80%以上，若能對其充分利用，不但可以提高魚類加工的附加值，而且可以減少海洋資源的浪費以及環(huán)境的污染，獲得良好的經(jīng)濟(jì)效益與社會效益，對促進(jìn)魚類產(chǎn)品加工業(yè)的發(fā)展具有重要意義[1-2]。目前魚類膠原蛋白在工業(yè)生產(chǎn)中所占的比例較小，相比于牛、豬等陸生動物的膠原蛋白，魚類膠原蛋白更容易酶解，且抗原性和過敏性也較低，這些理化性質(zhì)比陸生動物膠原蛋白更具有明顯的優(yōu)勢。我國鱈魚皮資源豐富，而國內(nèi)外對鱈魚皮的關(guān)注度不高，對鱈魚皮膠原蛋白肽的功能特性和抗氧化活性的研究比較少。鱈魚皮為加工副產(chǎn)品，約占加工量的7%～8%。魚皮中的干物質(zhì)有50%以上為膠原蛋白，因此鱈魚皮可作為一種新型的、富有優(yōu)勢的膠原蛋白資源[3-6]。該試驗旨在研究大西洋鱈魚皮蛋白多肽的功能特性和抗氧化活性，為其在食品、化妝品等相關(guān)領(lǐng)域的開發(fā)和應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

大西洋鱈魚皮購自舟山市水產(chǎn)品企業(yè)；胰蛋白酶購于北京亞太恒信生物有限公司；DPPH、乙醇、鄰二氮菲、硫酸亞鐵、H2O2、ABTS、氯化亞鐵、EDTA均購自國藥

集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 試驗儀器 U2800紫外分光光度計，上海光譜儀器公司；CR21G低溫高速離心機(jī)，日本日立公司；HWS12電熱恒溫水浴鍋，上海一恒儀器有限公司；Cogent u Scale超濾系統(tǒng)，美國密理博公司；DS-1高速組織攪拌機(jī)，上海標(biāo)本模型廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 鱈魚皮的預(yù)處理。

將干大西洋鱈魚皮清水浸泡2 h，去魚鱗、去碎肉后清洗干凈，剪碎成3 cm×3 cm的小方塊，用20倍魚皮質(zhì)量的0.1 mol/L的NaOH浸泡魚皮以脫去雜蛋白，浸泡12 h后，反復(fù)沖洗至中性，瀝干，組織攪拌機(jī)15 000 r/min攪碎15 min勻漿至糊狀。處理后的樣品于低溫儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 酶解液的制備。

將勻漿好的鱈魚皮取10 g，調(diào)解料液比，按照設(shè)定的條件加入適量的胰蛋白酶進(jìn)行酶解。酶解結(jié)束在100 ℃水浴下滅活10 min，冷卻至室溫后，在低溫高速離心機(jī)中以9 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，收上清液備用。

1.3.3 酶解工藝優(yōu)化。

篩選工藝的標(biāo)準(zhǔn)是分別以游離氨基氮含量和DPPH自由基清除率，考察料液比（A）、加酶量（B）、酶解時間（C）、酶解溫度（D）、E（pH）這5個因素對胰蛋白酶酶解制備鱈魚皮的抗氧化肽產(chǎn)生的影響。通過設(shè)計正交試驗確定大西洋鱈魚皮抗氧化肽提取的最佳工藝條件。L16（4.5）正交試驗設(shè)計因素和水平見表1。

1.3.3.1 電位滴定法測定游離氨基氮。

根據(jù)文獻(xiàn)[7]進(jìn)行游離氨基氮的測量。取10 mL的酶解液置于燒杯中，加60 mL的蒸餾水，磁力攪拌后用0.05 mol/L NaOH溶液滴定至pH為82，加入10 mL的甲醛混合均勻，再次用相同濃度的NaOH溶液繼續(xù)滴定至pH=9.2（記下消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)的毫升數(shù)V1），同時取70 mL的蒸餾水做試劑空白試驗（V2）。按下列公式計算游離氨基氮含量，游離氨基氮含量與水解度呈正相關(guān)。

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力。

根據(jù)文獻(xiàn)[8]

進(jìn)行DPPH的測量。0.3 mL樣品和2.7 mL質(zhì)量濃度為0.2 mmol/L的DPPH乙醇溶液混合并劇烈振蕩2 min，再將其放置于黑暗中1 h，于517 nm處測吸光度。以As為陽性對照。DPPH自由基清除率按以下公式計算：

1.3.4 酶解液的超濾與分離。

將大批量最優(yōu)條件下的滅活、離心后的酶解液進(jìn)行抽濾。除去酶解液中所含的固體雜質(zhì)，使固液分離。然后將酶解液的粗提液進(jìn)行超濾分段，分別過30、10、8、5 kD膜，將得到5個組分，依次為>30 kD（MD-Ⅰ）、>10～30 kD（MD-Ⅱ）、>8～10 kD（MD-Ⅲ）、>5～8 kD（MD-Ⅳ）、≤5 kD（MD-Ⅴ）。分別稱量15.0、10.0、5.0、2.5、1.0 mg/mL的MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ和MD粗體物進(jìn)行DPPH清除能力的測定，ABTS自由基清除試驗及亞鐵離子螯合能力測定。

1.3.5 抗氧化活性分析。

1.3.5.1 DPPH自由基清除能力。

不同濃度的樣品多肽對DPPH自由基的清除能力測定參照“1.3.3.2”方法。

1.3.5.2 ABTS自由基清除能力。

首先將ABTS溶于過硫酸鉀溶液（2.45 mmol/L）中使?jié)舛冗_(dá)到7 mmol/L，在暗室靜放16 h后，用PBS緩沖溶液稀釋，當(dāng)吸光度在734 nm下檢測值為0.70±0.02，該值為Ac。1 mL ABTS稀釋液與1 mL樣品充分混合，10 min后在734 nm紫外光下檢測，檢測值為As。按下列公式計算ABTS自由基的清除率：

ABTS自由基清除率=（Ac-As）/Ac×100%（3）

1.3.5.3 Fe.2+螯合能力測定。將100 μL不同濃度的樣品溶液加入微量離心管中，依次加入135 μL的去離子水和5 μL2 mmol/L的氯化亞鐵溶液，充分混勻，3 min后加入10 μL 5 mmol/L的菲咯嗪，劇烈振蕩后，在室溫下靜置10 min。

反應(yīng)后的溶液在562 nm處測其吸光度As。以去離子水作為空白對照測其吸光度Ac，EDTA代替樣品作為陽性對照?？寡趸呐cEDTA的Fe.2+螯合能力計算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳酶解工藝的確定

2.1.1 以游離氨基氮含量為指標(biāo)。

以游離氨基氮含量為指標(biāo)，采用L16（4.5）正交試驗確定鱈魚皮多肽胰蛋白酶解的最佳條件見表2。對表2正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果顯示，影響胰蛋白酶酶解物得率的各因素排序為：B=D>A>C=E，即加酶量和酶解溫度的影響最大，酶解時間和pH的影響最??；其最佳酶解條件為一A1B4C1D2E4，即料液比為1∶1，加酶量為2 500 U/g，酶解時間為4 h，酶解溫度為45 ℃，pH 為9。

2.1.2 以DPPH自由基清除率為指標(biāo)。

以DPPH自由基清除率為指標(biāo)，采用L16（4.5）正交試驗確定鱈魚皮多肽胰蛋白酶解的最佳條件見表3。

對表3正交試驗結(jié)果進(jìn)行極差分析，結(jié)果顯示，影響胰蛋白酶酶解物得率的各因素排序從大到小依次為A、B、D、C、E，即料液比的影響最大，pH的影響最小；其最佳酶解條件為A1B2C1D1E1，即料液比為1∶1，加酶量為1 500 U/g，酶解時間4 h，酶解溫度為40 ℃，pH 為6。

綜合分析以上2種方法，認(rèn)為最優(yōu)酶解條件為A1B4C1D2E4，即料液比為1∶1，加酶量為2 500 U/g，酶解時間為4 h，酶解溫度為45 ℃，pH為9。然后在該條件下按“1.3.1”方法大量提取得到大西洋鱈魚皮多肽的粗提物。

2.2 多肽對DPPH自由基的清除能力

經(jīng)超濾得到的5個組分，依次命名為MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ，配制成濃度為1.0、2.5、5.0、10.0和15.0 mg/mL濃度組，分別測定其DPPH自由基清除率，并以抗壞血酸（VC）為對照組。從圖1可看出，隨著濃度增加，活性肽MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ對DPPH自由基的清除能力也隨之增加，即兩者之間具有量效關(guān)系，但隨著分子段的減少，對DPPH自由基的清除能力也隨之增加。而與同濃度的抗壞血酸相比，活性比較低。其中，MD-Ⅴ（分子段≤5 kD）的DPPH清除能力較強(qiáng)，在濃度15 mg/mL時其清除能力最強(qiáng)，為75.23%。

2.3 多肽對ABTS自由基的清除能力 不同濃度和不同分子段活性肽對ABTS的清除能力結(jié)果見圖2。隨著濃度增加，活性肽MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ對ABTS的清除能力也隨之增加，具有量效關(guān)系，但與同濃度的抗壞血酸相比，活性較低。其中MD-Ⅴ（分子段≤5 kD）活性最強(qiáng)，在濃度為15 mg/mL時清除能力最高，達(dá)到99.50%。

2.4 多肽對Fe.2+螯合能力測定 從圖3可看出，隨著濃度增加，活性肽MD-Ⅰ、MD-Ⅱ、MD-Ⅲ、MD-Ⅳ、MD-Ⅴ對Fe.2+螯合能力也隨之增加，具有量效關(guān)系，但與同濃度的EDTA相比，活性較低。其中MD-Ⅴ（分子段≤5 kD）活性最強(qiáng)，在濃度為10 mg/mL時整合能力最高，達(dá)到77.83%。

3 結(jié)論

該試驗用胰蛋白酶提取大西洋鱈魚皮多肽，采用了L16（4.5）正交試驗，分別以游離氨基氮含量和DPPH自由基清除率為篩選指標(biāo)，綜合考慮后，確定的最佳條件為料液比為1∶1，加酶量為2 500 U/g，酶解時間為4 h，酶解溫度為45 ℃，pH為9，在此條件下，鱈魚皮多肽具有最高的提取率。

將酶解液超濾后獲得5個分子段，依次為分子量>30 kD（MD-Ⅰ）、>10～30 kD（MD-Ⅱ）、>8～10 kD（MD-Ⅲ）、>5～8 kD（MD-Ⅳ）、≤5 kD（MD-Ⅴ），經(jīng)抗氧化試驗，發(fā)現(xiàn)隨著酶解液濃度的增加，分子量的減少，當(dāng)分子量≤5 kD時對DPPH自由基清除、ABTS自由基清除力增加，但比同濃度的VC低；對Fe.2+螯合能力測定結(jié)果表明，分子量≤5 kD時活性最強(qiáng)，但較同濃度的EDTA相近，其余組分活性偏低。因此認(rèn)為經(jīng)胰蛋白酶提取的大西洋鱈魚皮多肽具有較好的抗氧化活性，這將為鱈魚皮的功能產(chǎn)品研發(fā)提供試驗依據(jù)，有望開發(fā)保健藥品等。

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