沈炫旭 張建 程呈

摘要 [目的]比較3個典型濕地的脫氮潛能，探討微生物學機制。[方法]在濕地中實地采樣，測定基質脫氮能力，通過高通量及實時定量PCR分析微生物學機制。[結果]黃河三角洲自然濕地（YRD）更有利于NO.-3的去除，東汶河人工濕地（DWR）與小湄河河流濕地（XMR）更有利于NH.+4的去除。DWR中nobL的拷貝數(shù)最高，而在YRD與XMR中差異不大；YRD基質中amoA的拷貝數(shù)低于DWR和XMR中。β-變形菌（β-Proteobacteria）在DWR和XMR中的相對豐度最高，而YRD中γ-變形菌（γ-Proteobacteria）最高。藍藻細菌（Cyanobateria）在DWR和XMR群落中占據比較重要的地位。[結論]雖然YRD中反硝化菌的數(shù)量最少，但是γ-Proteobacteria較高的豐度導致反硝化能力較高；而DWR與XMR具有較多的硝化和反硝化細菌，但是基質類型更有利于發(fā)生硝化反應。

關鍵詞 濕地；微生物群落；功能基因；脫氮；環(huán)境因素

中圖分類號 S181 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2018）23-0035-04

Abstract [Objective] To compare the potential capacity of denitrification in three typical wetlands and study the microbiology mechanism. [Method] Collecting samples in situ， to determine nitrogen removal capacity of substrate and study microbiological mechanism by means of qPCR and highthroughput sequencing analysis. [Result] YRD was more conducive to removing NO.-3， while DWR and XMR were more conducive to removing NH.+4. DWR had the highest copy of nobL， while there was no significant difference between YRD and XMR. YRD had the lowest copy of amoA. The relative abundance of βProteobacteria in DWR and XMR was the highest， while in YRD was γProteobacteria. Cyanobateria played an important role in DWR and XMR. [Conclusion] Although YRD has the lowest copy of denitrifying bacteria， the high abundance of γ Proteobacteria leads to strong denitrifying ability. DWR and XMR have more nitrifying and denitrifying bacteria， but the type of substrate is more conducive to nitrifying reaction.

Key words Wetland；Microflora；Function gene；Denitrification；Environmental factor

濕地是陸地生態(tài)系統(tǒng)和水生生態(tài)系統(tǒng)相互作用形成的獨特的生態(tài)系統(tǒng)。濕地在種群、生態(tài)系統(tǒng)和全球生態(tài)3個不同等級尺度上都有重要的生態(tài)功能，被稱為“生物超市”“文明的發(fā)源地”和“地球之腎”[1]。濕地有2種基本類型：天然濕地和人工濕地[2]。根據系統(tǒng)內的水力水流特性，人工濕地分為表流人工濕地和潛流人工濕地兩大類[3]。表流濕地與自然濕地相似，在飽和土壤基質上有淺層水面覆蓋流動（通常小于60 cm深）[4]，也是工程應用較多的一種濕地類型。

長久以來水體中氮素累積一直是一個令人擔憂的問題。濕地中的無機氮主要有氨氮（NH.+4）、亞硝酸鹽（NO.-2）和硝酸鹽（NO.-3）[5]。濕地脫氮主要包括微生物氨化、硝化-反硝化以及植物吸收和物理化學轉化，如沉淀和離子交換等[6]。其中微生物轉化是最重要的去除過程，占60%以上[7]。氮轉化的相關微生物功能基因主要有氨單氧酶（amoA）、膜結合硝酸還原酶（narG）、含銅亞硝酸還原酶（nirK）、含cd1的亞硝酸還原酶（nirS）和一氧化氮還原酶（nosZ）。研究表明，氨氮去除率受amoA控制，硝態(tài)氮去除率受narG基因影響[8]。

不同濕地類型對氮去除效果差異較大。據報道，濕地通過氨化作用去除氮的量為0.004～0.530 g/（m.2·d），通過硝化作用去除氮的量為0.010～2.150 g/（m.2·d），通過反硝化作用去除氮的量為0.003～1.020 g/（m.2·d）[9]。按照濕地形態(tài)學分類，我國的濕地類型主要為自然濕地、人工濕地和河流濕地。筆者研究了3種濕地類型基質的潛在脫氮能力，利用熒光定量PCR和高通量測序技術解析了其微生物學機制，以期為工程中濕地類型的選擇提供理論依據和科學支撐。

1 材料與方法

1.1 選址與采樣

試驗選取山東省內3處典型的濕地類型：①東營的黃河三角洲濕地（YRD，山東省最大的自然濕地），②蒙陰的東汶河濕地（DWR，人工濕地），③聊城的小湄河濕地（XMR，河流濕地）（圖1）。采用梅花取樣方法，每個濕地取3個土樣（0～20 cm深），將收集的每個土樣在除去根系和有機物后混合均勻，然后立即放入密閉的塑料袋中保鮮并轉移到實驗室，4 h內進行進一步的樣品處理。

1.2 理化性質分析

取樣時，分別使用溫度計、pH計（PHS-3C）和溶解氧儀（HQ30d 53LEDTM，HACH，USA）測定溫度、pH和溶解氧（DO）。使用1 mol/L的氯化鉀溶液提取基質中NH.+4、NO.-3和NO2.-，測定其含量。另外，使用重鉻酸鉀氧化法確定土壤中的有機碳含量（TOC）。

1.3 潛在氮去除試驗

轉移5 g基質樣品到100 mL經氬氣沖洗過的玻璃瓶中，并加入50 mL氬氣清洗過的去離子水。隨后，將樣品分成3組并進行不同的處理，分別是：①對照組，②添加NO.-3 組，③添加NH.+4組。將上述裝有樣品液的燒瓶放置于暗處，室溫下培養(yǎng)24 h。在試驗開始（加入氮源后0 h）和末尾（加入氮源后24 h）取水樣分析系統(tǒng)中氮和有機物的轉化。其中，水樣經離心分離并過0.45 μm濾膜后測定樣品中的NH.+4、NO.-3和NO.-2含量。

1.4 樣品DNA分析

使用土壤DNA提取試劑盒（MoBio，USA）提取總群落DNA。DNA濃度和純度用超微量分光光度計（Nano-Drop Technologies，USA）進行分析。選取amoA、AOA、amx、nobL、narG、nirK、nirS和nosZ進行qPCR，具體方法見參考文獻[10]，所有的樣品測量都設3個平行。每次qPCR試驗都包含1個陰性對照。在上海源序生物科技有限公司（Shanghai，China）進行高通量測序。

2 結果與分析

2.1 濕地水質和基質的理化性質

3個濕地的溫度相似。從表1可以看出，3個濕地上覆水pH為8～9，說明3個濕地都偏堿性。其中YRD的pH最大，堿性最強，其次是DWR。而3個濕地上覆水DO差異較大，DWR的DO最高（3.63 mg/L），而XMR的DO只有1.68 mg/L，可能是因為XMR和YRD的土壤為致密黏壤土，DWR為沙子，空隙比較大，利于基質中DO的傳輸[10]。3個濕地上覆水中，YRD的NH.+4、NO.-2、NO.-3和TOC濃度都是最低的，這與YRD是天然濕地，幾乎沒有污水排入有關。城市污水導致人工濕地中氮和TOC的濃度變高[11]。DWR中NH.+4、NO.-2、NO.-3濃度高于XMR，這是由于DWR用于凈化污水處理廠出水，而XMR是河道濕地，植物種類繁多，能夠攝取水中NH.+4、NO.-2和NO.-3等污染物[12]。DWR中TOC濃度略低于XMR，這可能是因為DO在DWR中的濃度比XMR高1.95 mg/L。與此同時，XMR濕地中植物較多，在秋末冬初會腐爛，進而導致XMR內的TOC濃度升高。水中較高的氮含量導致在基質中相應含量較高，比如DWR基質的NO.-3濃度最高，達1.59 mg/kg，然而在YRD和XMR中并未檢測到NO.-3（表2）。這是由于DWR地表水中DO較高，抑制了反硝化細菌的作用，造成NO.-3濃度升高。在3個濕地基質中，NH.+4濃度與DO呈負相關，而NO.-2幾乎無法檢測到。這可能是因為濕地基質DO較低，從而抑制了硝化細菌的活性。

2.2 潛在氮去除試驗結果

通過研究試驗前后水樣中氮濃度變化，可以確定不同類型濕地基質對氮的轉化能力。從圖2a可以看出，YRD和XMR對照組中氮的濃度幾乎不變。而DWR中NO.-3的濃度從0.15 mg/L增加到0.86 mg/L，這可能是由于DWR基質中含有NO.-3釋放的結果。從圖2b可以看出，添加NO.-3后，YRD中NO.-3的濃度從5.86 mg/L降低到355 mg/L，而NO.-2的濃度從0.02 mg/L增加到0.85 mg/L，說明YRD中硝酸鹽變?yōu)閬喯跛猁}，這是反硝化的第一步[13]。而DWR和XMR中，添加NO.-3反應前后，NO.-3幾乎沒有變化，可能跟其本身NO.-3累積，而DO相對較高比例與反硝化反應的發(fā)生有關。從圖2c可以看出，在添加NH.+4后，XMR的NH.+4濃度降低最多，達3.50 mg/L，硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度分別增加了2.30 mg/L和0.70 mg/L。這可能是由于XMR發(fā)生了部分硝化反應。DWR的NH.+4濃度從4.80 mg/L下降到3.00 mg/L，而NO.-3濃度從0.41 mg/L提高到1.60 mg/L，表明發(fā)生了硝化過程[14]。雖然XMR中消耗的NH.+4量最多，但是在XMR中發(fā)現(xiàn)了NO.-2的積累，說明在XMR中硝化反應進行不徹底，這可能是由于XMR中DO濃度不足以進行完全硝化反應。而在YRD中，基本未檢測到NH.+4濃度變化。

2.3 實時熒光定量PCR結果

圖3a代表了反硝化過程相關基因，在3個濕地中narG和nosZ的拷貝數(shù)沒有顯著差異，而DWR與XMR中narG的拷貝數(shù)高于YRD。雖然YRD中反硝化細菌的數(shù)量比DWR中少，但在添加硝酸鹽的試驗中表明，YRD更容易進行反硝化。結果表明，與反硝化有關的功能基因的數(shù)量與濕地基質的反硝化有一定的關系，但并不絕對。反硝化受多種因素的影響，包括硝酸鹽濃度、不同植物種類的殘留、O2的缺失、反硝化劑的存在、覆水的存在等[15]。圖3b顯示DWR中的nobL拷貝數(shù)為1.2×10.11 copies/g，而在YRD與XMR中nobL拷貝數(shù)約為3.0×10.9 copies/g。這可能是因為DWR的DO濃度高于另外2個濕地，相對有利于硝化細菌的生長。通過比較3個不同的濕地厭氧氨氧化基因的拷貝數(shù)，發(fā)現(xiàn)YRD的AOA拷貝數(shù)（3.0×10.8 copies/g）低于DWR（4.0×10.9 copies/g）和XMR（3.5×10.9 copies/g）。

2.4 高通量測序結果

高通量測序結果表明，DWR、XMR和YRD底泥樣品中的微生物群落結構存在明顯差異。圖4顯示在門水平上，3個樣品中相對豐度最高的2個菌種為變形菌門（Proteobacteria），分別為60.0%（DWR）、56.0%（XMR）和61.0%（YRD）；其次是擬桿菌門（Bacteroidetes），分別為12.0%（DWR）、21.0%（XMR）和20.0%（YRD）。此外，具有光合作用的藍藻細菌（Cyanobateria）在DWR和XMR群落中也占據比較重要的地位，相對豐度分別為8.5%和67%，而該類光合細菌在YRD中的相對豐度僅有0.2%。圖5a是樣品群落中變形菌門的進一步分析結果，DWR和XMR中的主導變形菌為β-變形菌（β-Proteobacteria），而YRD中的主導變形菌為γ-Proteobacteria。圖5b對擬桿菌門進行了進一步劃分，從圖中可以看出，3個樣品群落中的主導菌種均為擬桿菌（Bacteroidia）和未定地位的擬桿菌（Bacteroidetes incertae sedis），但XMR樣品中這2類菌種的相對豐度之和明顯大于另外2個樣品。結合圖4與圖5的分析可以得出結論：γ-變形菌（γ-Proteobacteria）導致了YRD中較好的反硝化能力[16]，而β-Proteobacteria和Cyanobateria造成了DWR和XMR較好的硝化能力[17-18]。

3 結論

雖然YRD中反硝化菌的數(shù)量最少，但是較低的DO和γ-Proteobacteria較高的豐度導致了反硝化能力較高；而DWR與XMR具有較多的硝化和反硝化細菌，但是較高的DO和β-Proteobacteria和Cyanobateria更有利于發(fā)生硝化反應。

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