周圓　單長(zhǎng)林　李孝軍　李雪松　楊賽軍

摘要 [目的]運(yùn)用微滴式數(shù)字PCR 技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米品系。[方法]基于微滴式數(shù)字PCR平臺(tái)，建立3種轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的二重微滴式數(shù)字PCR（ddPCR）檢測(cè)方法。[結(jié)果]特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該法只有特定品系的靶序列才有擴(kuò)增信號(hào)。靈敏度試驗(yàn)表明，該方法在10 pg基因組DNA用量時(shí)可定量檢測(cè)到2～16個(gè)拷貝。[結(jié)論]該研究建立的3種轉(zhuǎn)基因玉米品系定量檢測(cè)方法特異性強(qiáng)、靈敏度高，可用于進(jìn)出口農(nóng)產(chǎn)品中3種轉(zhuǎn)基因玉米品系成分的定量檢測(cè)。

關(guān)鍵詞 轉(zhuǎn)基因玉米；微滴式數(shù)字PCR；定量檢測(cè)

中圖分類(lèi)號(hào) S41-33 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）14-0175-04

Study on Detection of Genetically Modified Maize Lines Using Microdrop Digital PCR Technique

ZHOU Yuan， SHAN Changlin， LI Xiaojun et al

（Zhoushan EntryExit Inspection and Quarantine Bureau， Zhoushan， Zhejiang 316021）

Abstract [Objective]To detect the genetically modified maize lines using microdrop digital PCR technique.[Method]Based on the droplet digital PCR platform， we established a duplex ddPCR detection method for three kinds of genetically modified maize line TC1507， MIR162， MIR604. [Result]The results of specific experiments showed that only the target sequence of a specific strain can be amplified. Sensitivity experiments showed that the method can detect 2-16 copies of 10 pg genome DNA. [Conclusion]The quantitative detection methods of the three transgenic maize lines established in this study were highly specific and sensitive， and could be used for the quantitative detection of three GM maize lines components in the import and export agricultural products.

Key words Genetically modified maize；Droplet digital PCR （ddPCR）；Quantitative detection

我國(guó)目前從美國(guó)和阿根廷進(jìn)口的玉米大部分都是轉(zhuǎn)基因玉米，這其中至少包括35個(gè)品系，外加多基因復(fù)合品系，品系近50個(gè)。然而，2011年我國(guó)許可進(jìn)口的轉(zhuǎn)基因玉米品系只有11個(gè)，至2016年增加到13個(gè)品系，進(jìn)口玉米中難免會(huì)混入其他品系[1]。我國(guó)現(xiàn)行轉(zhuǎn)基因玉米檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)只著重轉(zhuǎn)基因成分的定性檢測(cè)，難以滿(mǎn)足我國(guó)已批準(zhǔn)的13個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系的定量檢測(cè)，更不能滿(mǎn)足更多的未批準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系的特異性鑒定和定量檢測(cè)。

目前對(duì)轉(zhuǎn)基因玉米采取的檢測(cè)方法主要是對(duì)一些特定轉(zhuǎn)基因玉米品系的定性檢測(cè)，如針對(duì)MON810建立檢測(cè)Cry1Ab蛋白的ELISA檢測(cè)方法[1]。凌杏園等[2]從美國(guó)進(jìn)口的近60萬(wàn)t轉(zhuǎn)基因玉米中檢出了國(guó)家批準(zhǔn)的11個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，還在全國(guó)首次從大宗原糧中檢出國(guó)家未批準(zhǔn)轉(zhuǎn)基因玉米品系MON89034。這為轉(zhuǎn)基因玉米品系特異性檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的制定打下了基礎(chǔ)。在定量檢測(cè)方面，宋君等[3]針對(duì)NK603品系建立了特異定量PCR檢測(cè)方法。鄧婷婷等[4]以轉(zhuǎn)基因玉米品系Mir162的性狀基因vip3a為靶標(biāo)，建立了實(shí)時(shí)熒光PCR和可視芯片檢測(cè)方法，結(jié)果表明2種方法都能特異性檢測(cè)玉米Mir162 品系，其中實(shí)時(shí)熒光PCR 檢測(cè)的相對(duì)靈敏度可達(dá)0.001%，可視芯片檢測(cè)靈敏度達(dá)0.010%。此研究建立的方法可用于進(jìn)境轉(zhuǎn)基因玉米中Mir162品系的檢測(cè)。

此外，轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)技術(shù)和方法日新月異。目前在轉(zhuǎn)基因檢測(cè)中得到廣泛應(yīng)用的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)是1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出的一種PCR技術(shù)，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，具有檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確、檢測(cè)周期短、特異性更強(qiáng)、靈敏度更高、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。2011年起，一種能進(jìn)行絕對(duì)定量檢測(cè)的數(shù)字PCR（Digital PCR，dPCR）也開(kāi)始推廣運(yùn)用，其對(duì)目標(biāo)序列拷貝數(shù)的定量不依賴(lài)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，且定量結(jié)果不受PCR擴(kuò)增效率影響[5-7]，標(biāo)志著PCR技術(shù)邁入第三代。Corbisier等[8]應(yīng)用數(shù)字PCR方法成功檢測(cè)轉(zhuǎn)基因玉米MON810品系，并發(fā)現(xiàn)此方法與實(shí)時(shí)PCR結(jié)果的一致性。

筆者主要將數(shù)字PCR方法運(yùn)用于轉(zhuǎn)基因玉米及其加工產(chǎn)品的定量檢測(cè)，建立起轉(zhuǎn)基因玉米數(shù)字PCR檢測(cè)技術(shù)體系并應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因玉米加工產(chǎn)品的實(shí)際檢測(cè)。一方面降低進(jìn)境玉米攜帶的轉(zhuǎn)基因?qū)Φ貐^(qū)生態(tài)和人們健康帶來(lái)的風(fēng)險(xiǎn)；另一方面，提高舟山口岸的檢測(cè)能力，打破技術(shù)壁壘，推動(dòng)企業(yè)轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品出口，提高舟山新區(qū)的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 材料

共選用13份材料，3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MIR604、TC1507，1份非轉(zhuǎn)基因玉米（表1）。

1.2 方法

1.2.1 模板DNA的提取。

采用Promega公司的DNA提取試劑盒（Wizard Magnetic DNA Purification System for Food）進(jìn)行基因組DNA的提取，并測(cè)定DNA濃度。

1.2.2 數(shù)字PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)條件。

ddPCR反應(yīng)包括4個(gè)步驟，分別為配制PCR反應(yīng)體系、生成微滴、PCR擴(kuò)增和微滴信號(hào)讀取。其反應(yīng)體系為20 μL，其中2×ddPCR Super Mix10 μL，玉米品系和內(nèi)參照（Zein）基因正反向引物各1 μL（終濃度500 nmol/L）、探針各0.5 μL（終濃度250 nmol/L），DNA模板（20 ng/μL）5 μL。生成微滴要用專(zhuān)門(mén)的微滴生成卡槽和微滴生成儀，將20 μL PCR反應(yīng)體系和70 μL微滴生成油（droplet generation oil）加入專(zhuān)用8通道微滴生成卡槽（droplet generator DG8 cartridge），并覆蓋配套膠墊（droplet generator DG8 gasket）后，置入微滴生成儀，生成微滴。

反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性30 s，57 ℃退火1 min，40個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增結(jié)束后進(jìn)行98 ℃、10 min的酶熱失活。擴(kuò)增結(jié)束后，將96孔板置入微滴讀取儀中讀取信號(hào)，并使用QuantaSoft V1.3.2軟件分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.2.3 檢測(cè)低限試驗(yàn)。

每個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MIR604、TC1507均有不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)（100%、10%、1%、0.1%）的樣品，每個(gè)樣品做2個(gè)重復(fù)擴(kuò)增，按照所建立的方法進(jìn)行檢測(cè)低限試驗(yàn)。靈敏性圖譜中藍(lán)色信號(hào)代表發(fā)生擴(kuò)增的微滴， 系統(tǒng)判讀為陽(yáng)性信號(hào)；灰色信號(hào)代表未發(fā)生擴(kuò)增的油滴，系統(tǒng)判讀為陰性信號(hào)；陽(yáng)性信號(hào)判斷標(biāo)準(zhǔn)為陰性玉米或者水對(duì)照陽(yáng)性微滴數(shù)的3倍以上即為陽(yáng)性微滴數(shù)。

1.2.4 特異性試驗(yàn)。

特異性試驗(yàn)共采用樣品5份，其中包括常見(jiàn)的轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162、MIR604和TC1507。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件優(yōu)化

行標(biāo)SN/T 1196—2012（轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè) 玉米檢測(cè)方法）中檢測(cè)Zein結(jié)構(gòu)基因特異性方法和檢測(cè)MIR162、MIR604、TC1507品系特異性方法均為單重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，筆者直接引用這2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)中引物探針序列，分別對(duì)MIR162、MIR604、TC1507這3個(gè)品系邊界序列采用5′-FAM—3′-BHQ1熒光標(biāo)記，Zein基因采用5′-HEX—3′-BHQ1熒光標(biāo)記（表2），并通過(guò)優(yōu)化反應(yīng)體系、反應(yīng)條件等，最終建立了轉(zhuǎn)基因玉米品系二重?cái)?shù)字PCR方法。

由圖1可知，在退火溫度為57 ℃時(shí)4組探針引物都體現(xiàn)出了良好的擴(kuò)增圖形，陰性微滴和陽(yáng)性微滴（藍(lán)色）可以明顯區(qū)分開(kāi)，根據(jù)微滴生成數(shù)及陽(yáng)性微滴數(shù)信號(hào)強(qiáng)度等指標(biāo)，確定57 ℃為該方法的最佳退火溫度。

2.2 靈敏度（檢測(cè)低限）和準(zhǔn)確性試驗(yàn)結(jié)果

分別對(duì)3個(gè)品系使用陽(yáng)性樣品梯度稀釋觀察該方法的重復(fù)性并進(jìn)行數(shù)字PCR檢測(cè)低限試驗(yàn)。從圖2～4可以看出，外源基因的檢測(cè)基本符合稀釋梯度且具有較好的重復(fù)性。

根據(jù)陽(yáng)性信號(hào)判定標(biāo)準(zhǔn)，MIR162、MIR604、TC1507品系在總基因組DNA濃度稀釋至10 pg時(shí)，可出現(xiàn)穩(wěn)定的陽(yáng)性擴(kuò)增，內(nèi)源基因Zein在基因組DNA濃度稀釋至10 pg時(shí)，也出現(xiàn)穩(wěn)定陽(yáng)性信號(hào)（圖5）， 故轉(zhuǎn)基因玉米3個(gè)品系的檢測(cè)定量低限可達(dá)10 pg，可見(jiàn)所建方法體系反應(yīng)靈敏度較高。由表3可知，內(nèi)外源基因不同濃度樣品檢測(cè)結(jié)果呈10倍梯度關(guān)系，定量結(jié)果準(zhǔn)確性較高。

2.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果

數(shù)字PCR擴(kuò)增后，其產(chǎn)物經(jīng)過(guò)微滴讀取儀分析，除目的基因外的品系均沒(méi)有擴(kuò)增，特異性試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6～8。

由圖6可知，F(xiàn)AM通道中其他轉(zhuǎn)基因玉米品系均未檢測(cè)到信號(hào)，而轉(zhuǎn)基因玉米品系MIR162出現(xiàn)信號(hào)，說(shuō)明MIR162品系引物和探針特異性結(jié)果很好。

3 討論

該試驗(yàn)建立了針對(duì)3種轉(zhuǎn)基因玉米品系TC1507、MIR162、MIR604的微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法?？紤]到二重微滴式數(shù)字PCR不僅能避免單重ddPCR定量因二次取樣所產(chǎn)生的樣品內(nèi)的誤差，而且可以消除不同樣品DNA因取樣不一致而造成的樣品間的誤差[7]，該研究采用二重PCR反應(yīng)擴(kuò)增。筆者專(zhuān)門(mén)對(duì)反應(yīng)體系和反應(yīng)條件包括引物探針終濃度、最佳退火溫度及內(nèi)參基因的選擇進(jìn)行了研究，確定了引物和探針的最佳終濃度分別為500和250 nmol/L，退火溫度在56～58 ℃時(shí)，擴(kuò)增效果良好，最終選擇57 ℃為最佳退火溫度。

用于3種轉(zhuǎn)基因玉米品系PCR檢測(cè)的外源探針引物和內(nèi)源探針引物特異性均較好，定量結(jié)果準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，檢測(cè)低限均可達(dá)10 pg。此外，同一品系不同含量轉(zhuǎn)基因玉米的質(zhì)量百分含量與拷貝數(shù)百分含量之間存在一定的線(xiàn)性關(guān)系，還有待下一步的試驗(yàn)驗(yàn)證。 因此，微滴式數(shù)字PCR檢測(cè)方法可以應(yīng)用于3個(gè)轉(zhuǎn)基因玉米品系的定量檢測(cè)工作。

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