涂小曼 劉茂林 張爍 謝光波

摘要 [目的]分析銀杏外果皮中揮發(fā)油的化學(xué)成分組成并評價其體外抗氧化活性。[方法]采用溶劑冷浸法提取銀杏外果皮中的揮發(fā)油，用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析揮發(fā)油化學(xué)組成，通過檢測揮發(fā)油對DPPH和ABTS自由基的清除能力進行體外抗氧化活性的評價。[結(jié)果]從銀杏外果皮揮發(fā)油中共鑒定出7種化合物，占揮發(fā)油總量的85.46 %，其主要成分為酚類衍生物（75.98 %）。揮發(fā)油的體外抗氧化活性檢測顯示，該揮發(fā)油對DPPH和ABTS自由基的半數(shù)清除濃度分別為4.23和2.36 mg/mL。[結(jié)論]銀杏外果皮揮發(fā)油具有一定的體外抗氧化活性，該研究可為銀杏外果皮的綜合利用提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞 銀杏;外果皮;揮發(fā)油;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用;抗氧化

中圖分類號 R284.1文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2018）34-0145-03

銀杏（Ginkgo biloba Linn）為銀杏科（Ginkgoaceae）銀杏屬植物，又稱為白果、公孫樹、鴨腳子，為中生代孑遺的稀有樹種，系我國特產(chǎn)[1]。銀杏在我國種植范圍非常廣泛，具有較好的藥用及食用價值。銀杏葉、銀杏葉提取物可用于治療痰血阻絡(luò)、胸痹心痛、中風(fēng)偏癱、肺虛咳嗽等[2]。銀杏種子白果仁常見于中醫(yī)用方中，具斂肺定喘、止帶縮尿的功效[3]，白果仁亦作為營養(yǎng)保健食品常見于市場，白果燉雞是我國一道特色傳統(tǒng)名菜。

銀杏外果皮是銀杏種子硬殼外面的肉質(zhì)皮層，俗稱白果衣胞[3]，通常情況下只取其仁，而將外果皮丟棄，既污染環(huán)境，又浪費了資源，因而有必要對其開展研究，實現(xiàn)其綜合利用。目前有關(guān)銀杏外果皮研究多側(cè)重于非揮發(fā)性化學(xué)成分，從中分離得到黃酮、脂肪酸、銀杏酚酸等多種類型化合物，而對其揮發(fā)性成分的組成及生物活性研究則鮮有文獻報道[3-5]。筆者對銀杏外果皮揮發(fā)性化學(xué)成分的組成及生物活性開展了研究，旨在為更好地利用銀杏外果皮提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料。銀杏外果皮于2017年11月收集自電子科技大學(xué)沙河校區(qū)銀杏林。

1.1.2 主要儀器。HP-6890/5973型GC-MS聯(lián)用儀（Hewlett-Packard，USA）;ELX 808型全自動酶標儀（BioTek Instruments，USA）;BSA124S型電子天平（Sartorius，Germany）;RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮）;DRT-TW型電熱套（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）。

1.1.3 主要試劑。1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，Sigma-Aldrich，USA），2，2-聯(lián)氨-二（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）二銨鹽（ABTS，東京化成），其他試劑均為分析純（成都科龍）。

1.2 方法

1.2.1 揮發(fā)油的提取。取新鮮銀杏外果皮破碎后，裝入1 000 mL圓底燒瓶中，加入重蒸石油醚250 mL，冷浸5 d。冷浸液經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，低溫回收石油醚，得到具有特殊刺激性氣味的淡黃色蠟狀固體2.407 g，揮發(fā)油樣品置于冰箱中4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 GC-MS測定條件。

1.2.2.1 氣相色譜條件。色譜柱為HP-5MS毛細管柱（30 m×0.25 mm × 0.25 μm）;程序升溫：從60 ℃開始，以10 ℃/min升到120 ℃，然后再以20 ℃/min升到220 ℃，最后以10 ℃/min升到280 ℃;進樣口溫度為270 ℃;載氣為He;柱流量：0.8 mL/min;進樣量：0.1 μL，分流比：50∶1。

1.2.2.2 質(zhì)譜條件。EI離子源;電離電壓：70 eV;離子源溫度：230 ℃;四級桿溫度：150 ℃;GC-MS接口溫度280 ℃;掃描范圍 20 ～ 450 Amu。

1.2.3 抗氧化生物活性測定。

1.2.3.1 DPPH法[6-7]。精確稱取DPPH 5 mg，用無水乙醇溶解并定容于50 mL容量瓶中，濃度為0.1 mg/mL，避光保存。

取96孔板，加入100 μL不同濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mg/mL）的揮發(fā)油乙醇溶液，然后再分別加入100 μL新配制的DPPH溶液，避光反應(yīng)30 min后，用酶標儀在540 nm波長下測定其吸光度。分別以無水乙醇和維生素C作為空白和陽性對照，每個揮發(fā)油濃度重復(fù)3次。

式（1）中，Ai為不同濃度樣品與DPPH溶液的混合液的吸光度;Aj為不同濃度樣品與無水乙醇的混合液的吸光度;A0為DPPH溶液與無水乙醇的混合液的吸光度。

1.2.3.2 ABTS法[8]。將5 mL 7.4 mmol/L的ABTS儲備液與88 μL 2.6 mmol/L K2S2O8儲備液混合，避光靜置12 h后得到ABTS工作母液，再用雙蒸水稀釋8倍后得到ABTS工作液，備用。

取96孔板，加入100 μL不同濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 mg/mL）的揮發(fā)油乙醇溶液，然后再分別加入100 μL新配制的ABTS工作液，室溫條件下靜置反應(yīng)10 min后，用酶標儀在波長405 nm下測定其吸光度。分別以無水乙醇和維生素C作為空白和陽性對照，每個揮發(fā)油濃度重復(fù)3次。

式（2）中，Ai為不同濃度樣品與ABTS工作液的混合液的吸光度;Aj為不同濃度樣品與雙蒸水的混合液的吸光度;A0為ABTS工作液與無水乙醇的混合液的吸光度。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理。樣品中各揮發(fā)性成分通過與Wiley 7、NIST 05標準質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫檢索比對確認，采用峰面積歸一化方法定量分析揮發(fā)油成分相對含量。運用SPSS軟件求取清除率達到50 %時的樣品濃度（IC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 銀杏外果皮揮發(fā)油化學(xué)成分 銀杏外果皮揮發(fā)油各成分的相對含量按峰面積歸一化法計算并確認，其總離子流圖譜如圖1所示。經(jīng)檢索譜庫并結(jié)合質(zhì)譜圖中基峰、質(zhì)荷比一級相對豐度與標準圖譜的對比，鑒定出7個組分（表1），占總峰面積的85.46 %，其中酚類衍生物占75.98 %，主要成分為白果酚（ginkgol），含量達到53.32 %。

2.2 銀杏外果皮揮發(fā)油體外抗氧化能力 由圖2a可知，銀杏外果皮揮發(fā)油對DPPH和ABTS自由基均具有一定的清除能力，且該能力皆隨著揮發(fā)油濃度的升高而逐漸增強，當(dāng)揮發(fā)油濃度為40.000 mg/mL時，其對DPPH自由基的清除率達到97.76 %，而對ABTS自由基清除率達到84.98 %。通過SPSS軟件計算得出銀杏外果皮揮發(fā)油對DPPH和ABTS自由基的半數(shù)清除濃度（IC50）分別為4.23和2.36 mg/mL。與此同時，陽性對照維生素C對DPPH和ABTS自由基的IC50分別為0.018和0.046 mg/mL（圖2b）。

3 結(jié)論與討論

前期采用水蒸氣蒸餾法并結(jié)合溶劑萃取進行銀杏外果皮中揮發(fā)油的提取，但揮發(fā)油收率過低，因而該研究采用溶劑冷浸法。文獻報道以二氯甲烷為溶劑，采用同時蒸餾萃取法得到的揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果顯示其主成分為脂肪酸類化合物，己酸含量達到65.88 %[5]。而該研究獲得的揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果顯示雖然也含有脂肪酸（丁酸 2.70 %和己酸 1.29 %），但其主成分為酚類衍生物（75.98 %），其中白果酚含量高達53.32 %，這一成分上的差異可能和提取方法的不同相關(guān)，也可能和銀杏的不同生長環(huán)境相關(guān)。此外，銀杏外果皮的化學(xué)成分研究亦顯示其含有酚類化合物，如白果酚、銀杏酚等[9-10]。

有研究表明，銀杏外果皮多糖具有提高免疫力、清除自由基、抗衰老、抗炎及抗腫瘤作用[11-15]，銀杏外果皮內(nèi)所含酚酸類化合物具有抗腫瘤活性[9-10]，銀杏外果皮提取物亦具有抑制真菌生長的活性[16-17]。鑒于溶劑冷浸法所得銀杏外果皮富含酚類化合物，筆者對其體外抗氧化活性進行了檢測。研究結(jié)果表明，銀杏外果皮揮發(fā)油對DPPH和ABTS自由基均顯示出一定的清除活性，但明顯弱于陽性對照維生素C，這是首次測定了銀杏外果皮揮發(fā)油成分的體外抗氧化活性。該研究結(jié)果為銀杏外果皮的綜合利用提供了科學(xué)依據(jù)。

參考文獻

[1]中國科學(xué)院《中國植物志》編委會.中國植物志：第7卷[M].北京：科學(xué)出版社，1978：18-22.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：2015年版一部[S].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：316-317，416-417.

[3]唐于平，樓鳳昌，王歡，等.銀杏外種皮的化學(xué)成分和藥理作用[J].藥學(xué)進展，2000，24（3）：152-155.

[4]趙肅清，李鋒，孫遠明.銀杏外種皮研究進展[J].武漢植物學(xué)研究，2000，18（6）：515-518.

[5]韓帥，苗志偉，劉玉平，等.銀杏外種皮揮發(fā)性成分分析[J].食品科學(xué)，2012，33（14）：146-149.

[6]CHEN Y，ZHANG H，TIAN X，et al.Antioxidant potential of crocins and ethanol extracts of Gardenia jasminoides ELLIS and Crocus sativus L.：A relationship investigation between antioxidant activity and crocin contents[J].Food chemistry，2008，109（3）：484-492.

[7]XIE Y，XIE G B，CHEN B，et al.Chemical composition，antibacterial and antioxidative activities of essential oil from Ligularia pleurocaulis[J].Asian journal of chemistry，2014，26（15）：4807-4809.

[8]IRITI M，VITALINI S，APOSTOLIDES N A，et al.Chemical composition and antiradical capacity of essential oils from Lebanese medicinal plants[J].Journal of essential oil research，2014，26（6）：466-472.

[9]ITOKAWA H，TOTSUKA N，NAKAHARA K，et al.Antitumor principles from Ginkgo biloba L.[J].Chemical & pharmaceutical bulletin，1987，35（7）：3016-3020.

[10]LEE J S，CHO Y S，PARK E J，et al.Phospholipase Cγ1 inhibitory principles from the sarcotestas of Ginkgo biloba[J].Journal of natural products，1998，61（7）：867-871.

[11]顧維戎，許愛華，汪正興.銀杏外種皮對小鼠免疫功能的影響[J].揚州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1989，1（1）：4-6.

[12]許愛華，陳華圣，王玲，等.銀杏外種皮多糖對不同狀態(tài)小鼠血清SOD和MDA形成的影響[J].中國中藥雜志，1998，23（12）：746-747.

[13]許愛華，王玲，陳華圣，等.銀杏外種皮多糖延緩小鼠衰老的實驗研究[J].中藥材，1996，19（9）：466-468.

[14]許愛華，顧維戎，許正新.銀杏外種皮多糖的抗炎作用[J].揚州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1991，3（1）：4-6.

[15]許愛華，陳華圣，項曉仁，等.銀杏外種皮多糖對小鼠腫瘤的抑制作用[J].中藥藥理與臨床，1996，12（5）：24-26.

[16]徐立春，童鯤，顧維戎，等.銀杏外種皮中間體取物抑制真菌生長的實驗研究[J].中藥材，1990，13（6）：36-37.

[17]徐立春，童鯤，程鵬，等.銀杏外種皮提取物對致病性真菌生長抑制的研究[J].微生物學(xué)通報，1991，18（4）：225-227.